Juxtanodin特異性抗體的制備與結構分析.pdf

1、目的：對Juxtanodin（JN）的氨基酸序列特點及分子結構進行分析，制備并純化JN的多克隆抗體，觀察JN對少突膠質細胞形態(tài)的影響，為進一步研究JN分子的功能，尤其是對中樞神經系統(tǒng)髓鞘形成的作用奠定基礎。方法：PCR擴增JN氨基端170個氨基酸（JN170）的核苷酸序列，構建pET41a(+)-JN170原核表達載體，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，誘導表達GST-JN170融合蛋白，純化重組融合蛋白，分別用傳統(tǒng)法和快速法免疫家兔制備

2、JN抗血清，并對免疫后的抗血清進行親和純化，westernblot鑒定JN抗血清和純化后抗體的反應特異性，應用免疫組織化學、細胞免疫熒光和組織免疫熒光等方法確定JN在細胞中的定位以及對細胞形態(tài)的影響。利用生物信息學方法，對JN的氨基酸序列及結構特點進行分析，初步驗證JN的蛋白酶活性。結果：測序證實原核表達載體pET41a(+)-JN170和真核表達載體pcDNA3.1myc-his(-)-JN構建成功；SDS-PAGE電泳分析證明獲得了

3、可溶性形式表達的GST-JN170融合蛋白；應用純化的重組蛋白免疫家兔，獲得了JN170抗血清，親和純化后得到純化的JN170抗體。Westernblot證明傳統(tǒng)法和快速法都能夠產生具有特異性的JN170抗血清，但快速法的特異性更高。細胞免疫熒光發(fā)現(xiàn)JN分子在少突膠質細胞中主要分布在胞漿和細胞突起中。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)JN的C端含有一個Actin結合結構域，屬于ERM蛋白家族的保守結構序列，不同種屬JN的N端氨基酸序列存在差異。還原與非

4、還原電泳結合westernblot證明JN分子并不以二聚體形式存在，但可能存在其他形式的修飾。JN170可能具有蛋白酶活性。結論：成功構建了JN分子的原核和真核表達載體，獲得了可溶性的GST-JN170重組融合蛋白。通過快速法和傳統(tǒng)法分別獲得了特異性的JN170抗血清和親和純化抗體，并發(fā)現(xiàn)JN分子在細胞中主要分布在胞漿和細胞突起中，提示JN可能與細胞運動和細胞形態(tài)的改變密切相關。對其結構的分析發(fā)現(xiàn)JN的C端含有一個actin結合結構域，