Juxtanodin特異性抗體的制備與結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、目的：對(duì)Juxtanodin（JN）的氨基酸序列特點(diǎn)及分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，制備并純化JN的多克隆抗體，觀察JN對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響，為進(jìn)一步研究JN分子的功能，尤其是對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成的作用奠定基礎(chǔ)。方法：PCR擴(kuò)增JN氨基端170個(gè)氨基酸（JN170）的核苷酸序列，構(gòu)建pET41a(+)-JN170原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)GST-JN170融合蛋白，純化重組融合蛋白，分別用傳統(tǒng)法和快速法免疫家兔制備

2、JN抗血清，并對(duì)免疫后的抗血清進(jìn)行親和純化，westernblot鑒定JN抗血清和純化后抗體的反應(yīng)特異性，應(yīng)用免疫組織化學(xué)、細(xì)胞免疫熒光和組織免疫熒光等方法確定JN在細(xì)胞中的定位以及對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響。利用生物信息學(xué)方法，對(duì)JN的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行分析，初步驗(yàn)證JN的蛋白酶活性。結(jié)果：測(cè)序證實(shí)原核表達(dá)載體pET41a(+)-JN170和真核表達(dá)載體pcDNA3.1myc-his(-)-JN構(gòu)建成功；SDS-PAGE電泳分析證明獲得了

3、可溶性形式表達(dá)的GST-JN170融合蛋白；應(yīng)用純化的重組蛋白免疫家兔，獲得了JN170抗血清，親和純化后得到純化的JN170抗體。Westernblot證明傳統(tǒng)法和快速法都能夠產(chǎn)生具有特異性的JN170抗血清，但快速法的特異性更高。細(xì)胞免疫熒光發(fā)現(xiàn)JN分子在少突膠質(zhì)細(xì)胞中主要分布在胞漿和細(xì)胞突起中。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)JN的C端含有一個(gè)Actin結(jié)合結(jié)構(gòu)域，屬于ERM蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)序列，不同種屬JN的N端氨基酸序列存在差異。還原與非

4、還原電泳結(jié)合westernblot證明JN分子并不以二聚體形式存在，但可能存在其他形式的修飾。JN170可能具有蛋白酶活性。結(jié)論：成功構(gòu)建了JN分子的原核和真核表達(dá)載體，獲得了可溶性的GST-JN170重組融合蛋白。通過(guò)快速法和傳統(tǒng)法分別獲得了特異性的JN170抗血清和親和純化抗體，并發(fā)現(xiàn)JN分子在細(xì)胞中主要分布在胞漿和細(xì)胞突起中，提示JN可能與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞形態(tài)的改變密切相關(guān)。對(duì)其結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)JN的C端含有一個(gè)actin結(jié)合結(jié)構(gòu)域，