24633.泛素特異性蛋白酶usp2和usp8催化機(jī)制和底物特異性研究

1、學(xué)校代碼：—102—00分類號(hào)：監(jiān)研究生學(xué)號(hào)：—1020020—0710246密級(jí)：五彭i雩亭磅I掌鼢，；、、：窆蘭：二／東牡，葒大季博士學(xué)位論文泛素特異性蛋白酶USP2和USP8催化機(jī)制和底物特異性研究TheStudyofcatalyticmechanismandsubstratespecificityofUbiquitinspecificityEnzymesUSP2andUSP8指導(dǎo)教師學(xué)科專業(yè)研究方向作者：張萬(wàn)方李玉新教授Robe

2、rtMenard教授細(xì)胞生物學(xué)蛋白酶結(jié)構(gòu)與功能東北師范大學(xué)學(xué)位評(píng)定委員會(huì)2011年5月摘要蛋白的去泛素化作用是翻譯后修飾，這一修飾作用通過(guò)影響被修飾蛋白的穩(wěn)定性、定位和功能等在很多細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。泛素與靶蛋白的結(jié)合是通過(guò)形成一個(gè)復(fù)合物來(lái)完成的，這是一個(gè)多步驟的級(jí)聯(lián)過(guò)程，至少需要三種酶的參與：泛素激活酶El，泛素接合酶E2和泛素連接酶E3，它們激活并轉(zhuǎn)移泛素及泛素類似物到靶蛋白內(nèi)部的賴氨酸殘基的￡一氨基上。被結(jié)合上K48連接

3、泛素鏈的靶蛋白通過(guò)泛素蛋白酶體系統(tǒng)被降解，泛素的非蛋白酶體功能包括其它位置賴氨酸連接的多聚泛素鏈和單泛素化作用。泛素化作用是可逆的過(guò)程，泛素的羧基末端甘氨酸與靶蛋白的賴氨酸殘基連接的異肽鍵，或者是其它的在多聚泛素鏈中的泛素分子能夠被去泛素化酶切除掉。這種酶也作用于泛素及泛素類似物的前體產(chǎn)生出有活性的泛素及泛素類似物。在哺乳動(dòng)物中的大約有100種DUBs已經(jīng)在人體基因組中得到鑒定。DUBs可以分為五個(gè)不同的家族，其中有四個(gè)家族是半胱氨酸蛋

4、白酶，它們是：泛素C末端水解酶(UCH)、泛素特異性蛋白酶(USP)、卵巢癌相關(guān)蛋白酶(OTU)和MachadoJosephdomain(MJD)DUBs。USPs是一個(gè)家族成員最多、結(jié)構(gòu)差異最大的去泛素化酶亞家族，許多USPs都有重要的生物學(xué)作用，是腫瘤干擾治療的重要潛在靶標(biāo)。USP的催化結(jié)構(gòu)域與抑制劑Ubal復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)分析指出，三個(gè)保守的氨基酸殘基Cys、His和推測(cè)的第三個(gè)保守氨基酸殘基Asp或Asn組成催化三聯(lián)體，它們是由

5、四面體瞬間結(jié)構(gòu)形成的氧離子洞中間的水分子橋來(lái)穩(wěn)定的。本研究通過(guò)表達(dá)USP2和USP8的催化結(jié)構(gòu)域，點(diǎn)突變分析了催化位點(diǎn)殘基在水解肽鍵和異肽鍵底物中的作用，由于異肽鍵底物K48連接的DiUb沒有熒光因子標(biāo)記，因此我們引入了質(zhì)譜分析檢測(cè)催化過(guò)程。USP2在分解DUBs的通用底物L(fēng)ibAMC時(shí)，催化位點(diǎn)的突變體對(duì)酶的活性沒有產(chǎn)生影響。對(duì)游離的USP2以及USP2與底物四面體瞬間結(jié)構(gòu)復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬實(shí)驗(yàn)得出，在乙酰化作用步

6、驟中Asn218在結(jié)構(gòu)上直接穩(wěn)定氧離子，同時(shí)它受到臨近的氨基酸殘基Asp482的支持。突變實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)酶的催化特異性并不依賴于底物間化學(xué)鍵即肽鍵或異肽鍵的性質(zhì)，而是在于底物本身。另外我們還發(fā)現(xiàn)氨基酸殘基Asn481結(jié)構(gòu)上處于催化三聯(lián)體第三位成員的位置，但是它卻不能獨(dú)自完成該功能。雙突變和結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)保守氨基酸殘基Asp482與Asn481協(xié)同作用維持結(jié)構(gòu)正確的排列和穩(wěn)定His464的質(zhì)子化作用。USP8的結(jié)果與USP不盡相同，在分解通用底