泛素特異性蛋白酶USP12的分子克隆.pdf

1、目的：泛素介導的蛋白質降解可調控細胞內大量生命活動，包括細胞周期、DNA修復、轉錄調控、免疫應答和信號傳導。泛素與蛋白質的連接是由泛素活化酶E1、泛素結合酶E2和泛素-蛋白連接酶E3依次催化完成的。去泛素化酶(DUB)通過去除蛋白質上連接的泛素，從而對蛋白質的泛素化進行負向調節(jié)。人類基因組編碼大約95種DUB，按其序列相似性和作用機制可分為五個家族，分別是：泛素特異性蛋白酶(USPs)、泛素羧基末端水解酶(UCHs)、卵巢腫瘤相關蛋白酶

2、(OTUs)、含Machado-Joseph結構域的MJD和含金屬蛋白酶結構域的JAMM蛋白酶。
　　 USP是DUB中種類最多、成員結構最為多樣的一個家族。盡管不同的USP長短不等、結構各異，但它們的氨基酸序列中都含有高度保守的半胱氨酸(Cys)、組氨酸(His)和天冬氨酸(Asp)結構域。目前研究發(fā)現，USP調控大量體內生物和病理進程，包括穩(wěn)定腫瘤抑制因子p53、調控細胞生長、抑制凋亡、調控發(fā)育進程和抑制基因沉默等。

3、　　 本研究從大鼠腦組織和人類A549腫瘤細胞株中分離了一個新的泛素特異性蛋白酶基因usp12。同時分析了大鼠usp12基因在各組織中的分布情況，并對其去泛素化酶活性進行了研究。大鼠和人類USP12均具有去泛素化酶活性，但人類USP12的SNP，第173位組氨酸突變?yōu)樘於彼岷蟛荒芗羟械孜?，表明該SNP可能具有重要作用。
　　 方法：
　　 (1)大鼠usp12的克隆。利用TRNzol從大鼠腦組織中提取總RNA，反轉錄

4、合成第一鏈cDNA，并利用usp12的特異引物進行PCR擴增。PCR產物克隆至pGEM-T easy載體并轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。經BamHI和SalI酶切檢測后，含預期大小條帶的質粒進一步測序鑒定。
　　 (2)大鼠usp12的組織分布通過實時熒光定量PCR技術進行分析。首先從大鼠大腦、心、腎、肝、肺、骨骼肌、脾和睪丸等組織中提取總RNA。以大鼠usp12與GAPDH特異引物和一步法real-time PCR試劑盒進行

5、PCR擴增。結果的計算基于熒光信號到達閾值所需循環(huán)數（Ct值），最后求得2-ΔΔCt即為各組織usp12的相對表達水平。
　　 (3)大鼠USP12融合蛋白的表達。經BamH I和Sal I酶切后，將大鼠usp12插入GST表達質粒pGEX-6p-1并轉化DH5α感受態(tài)細胞。經IPTG誘導4小時后，細菌總裂解液及其上清和沉淀進行10％SDS-PAGE分析。
　　 (4)去泛素化酶活性分析。表達質粒pGEX-6p-1，pR

6、B-UBP2，pGEX-rusp12和pGEX-rusp12(C48S)與pAC-ub-met-β-gal共轉化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞。經IPTG誘導后，7％SDS-PAGE并利用小鼠抗β-gal抗體進行蛋白質的印跡分析。
　　 (5)人類usp12的克隆。利用TRNzol從人類A549細胞中提取總RNA，并利用usp12特異引物進行PCR反應。將usp12插入pGEX-6p-1，并利用PfuDNA聚合酶對氨基酸第173位組

7、氨酸進行點突變。以Ub-Met-β-gal進行去泛素化酶活性分析。
　　 結果：
　　 (1)大鼠USP12基因編碼區(qū)含1113個堿基，編碼370個氨基酸，推測其分子量為43KDa。它含有泛素特異性蛋白酶高度保守的半胱氨酸、組氨酸和天冬氨酸結構域。
　　 (2)Usp12在大鼠各組織中均有表達，在脾和肺中表達較多，在睪丸、腎、大腦和肝中表達量居中，在心和骨骼肌中表達較少(3)經IPTG誘導和SDS-PAGE檢測可

8、發(fā)現在大腸桿菌DH5α中表達出GST-USP12融合蛋白，其分子量大約為70KDa。
　　 (4)去泛素化酶活性分析表明大鼠USP12可將底物Ub-Met-β-gal上的泛素去除，其具有去泛素化酶活性。
　　 (5)人類USP12基因編碼區(qū)含1113個堿基，編碼370個氨基酸，推測其分子量為43KDa。野生型人類USP12具有去泛素化酶活性，但SNP突變型，即第173位組氨酸突變?yōu)樘於彼岷?，不能檢測到活性。