泛素特異性蛋白酶USP12的分子克隆.pdf

1、目的：泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)大量生命活動(dòng)，包括細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、免疫應(yīng)答和信號(hào)傳導(dǎo)。泛素與蛋白質(zhì)的連接是由泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素-蛋白連接酶E3依次催化完成的。去泛素化酶(DUB)通過去除蛋白質(zhì)上連接的泛素，從而對(duì)蛋白質(zhì)的泛素化進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié)。人類基因組編碼大約95種DUB，按其序列相似性和作用機(jī)制可分為五個(gè)家族，分別是：泛素特異性蛋白酶(USPs)、泛素羧基末端水解酶(UCHs)、卵巢腫瘤相關(guān)蛋白酶

2、(OTUs)、含Machado-Joseph結(jié)構(gòu)域的MJD和含金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域的JAMM蛋白酶。
　　 USP是DUB中種類最多、成員結(jié)構(gòu)最為多樣的一個(gè)家族。盡管不同的USP長(zhǎng)短不等、結(jié)構(gòu)各異，但它們的氨基酸序列中都含有高度保守的半胱氨酸(Cys)、組氨酸(His)和天冬氨酸(Asp)結(jié)構(gòu)域。目前研究發(fā)現(xiàn)，USP調(diào)控大量體內(nèi)生物和病理進(jìn)程，包括穩(wěn)定腫瘤抑制因子p53、調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制凋亡、調(diào)控發(fā)育進(jìn)程和抑制基因沉默等。

3、　　 本研究從大鼠腦組織和人類A549腫瘤細(xì)胞株中分離了一個(gè)新的泛素特異性蛋白酶基因usp12。同時(shí)分析了大鼠usp12基因在各組織中的分布情況，并對(duì)其去泛素化酶活性進(jìn)行了研究。大鼠和人類USP12均具有去泛素化酶活性，但人類USP12的SNP，第173位組氨酸突變?yōu)樘於彼岷蟛荒芗羟械孜?，表明該SNP可能具有重要作用。
　　 方法：
　　 (1)大鼠usp12的克隆。利用TRNzol從大鼠腦組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄

4、合成第一鏈cDNA，并利用usp12的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物克隆至pGEM-T easy載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)BamHI和SalI酶切檢測(cè)后，含預(yù)期大小條帶的質(zhì)粒進(jìn)一步測(cè)序鑒定。
　　 (2)大鼠usp12的組織分布通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行分析。首先從大鼠大腦、心、腎、肝、肺、骨骼肌、脾和睪丸等組織中提取總RNA。以大鼠usp12與GAPDH特異引物和一步法real-time PCR試劑盒進(jìn)行

5、PCR擴(kuò)增。結(jié)果的計(jì)算基于熒光信號(hào)到達(dá)閾值所需循環(huán)數(shù)（Ct值），最后求得2-ΔΔCt即為各組織usp12的相對(duì)表達(dá)水平。
　　 (3)大鼠USP12融合蛋白的表達(dá)。經(jīng)BamH I和Sal I酶切后，將大鼠usp12插入GST表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-1并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4小時(shí)后，細(xì)菌總裂解液及其上清和沉淀進(jìn)行10％SDS-PAGE分析。
　　 (4)去泛素化酶活性分析。表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-1，pR

6、B-UBP2，pGEX-rusp12和pGEX-rusp12(C48S)與pAC-ub-met-β-gal共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，7％SDS-PAGE并利用小鼠抗β-gal抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)的印跡分析。
　　 (5)人類usp12的克隆。利用TRNzol從人類A549細(xì)胞中提取總RNA，并利用usp12特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。將usp12插入pGEX-6p-1，并利用PfuDNA聚合酶對(duì)氨基酸第173位組

7、氨酸進(jìn)行點(diǎn)突變。以Ub-Met-β-gal進(jìn)行去泛素化酶活性分析。
　　 結(jié)果：
　　 (1)大鼠USP12基因編碼區(qū)含1113個(gè)堿基，編碼370個(gè)氨基酸，推測(cè)其分子量為43KDa。它含有泛素特異性蛋白酶高度保守的半胱氨酸、組氨酸和天冬氨酸結(jié)構(gòu)域。
　　 (2)Usp12在大鼠各組織中均有表達(dá)，在脾和肺中表達(dá)較多，在睪丸、腎、大腦和肝中表達(dá)量居中，在心和骨骼肌中表達(dá)較少(3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE檢測(cè)可

8、發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌DH5α中表達(dá)出GST-USP12融合蛋白，其分子量大約為70KDa。
　　 (4)去泛素化酶活性分析表明大鼠USP12可將底物Ub-Met-β-gal上的泛素去除，其具有去泛素化酶活性。
　　 (5)人類USP12基因編碼區(qū)含1113個(gè)堿基，編碼370個(gè)氨基酸，推測(cè)其分子量為43KDa。野生型人類USP12具有去泛素化酶活性，但SNP突變型，即第173位組氨酸突變?yōu)樘於彼岷?，不能檢測(cè)到活性。