NKAIN2通過鈉鉀泵β1亞基抑制前列腺癌增殖和進(jìn)展的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　前列腺癌占西方發(fā)達(dá)國(guó)家男性惡性腫瘤發(fā)病率首位，近年來在中國(guó)的發(fā)病率也逐年上升。大部分的前列腺癌屬于相對(duì)惰性的腫瘤，然而部分前列腺癌進(jìn)展迅速，并很快發(fā)生轉(zhuǎn)移威脅病人生命，如何區(qū)分這部分進(jìn)展迅速的病人，研究前列腺癌增殖進(jìn)展的分子機(jī)制，對(duì)提高前列腺癌病人的生存率意義重大。
　　早期研究者將NKAIN2命名為T細(xì)胞淋巴瘤斷裂位點(diǎn)相關(guān)靶點(diǎn)1(T-cell lymphoma breakpoint associated tar

2、get1(TCBA1))，基于能與鈉鉀泵β1亞基相互作用(Na，K-ATPase)而被命名為鈉鉀泵相互作用因子2，屬于NKAIN跨膜蛋白超家族的一員。課題組前期通過高通量SNP芯片分析發(fā)現(xiàn)NKAIN2在前列腺癌標(biāo)本中發(fā)生斷裂及缺失，推測(cè)NKAIN2可能是抑癌基因。進(jìn)一步通過分析大量前列腺癌樣本，發(fā)現(xiàn)前列腺癌中，尤其是中國(guó)的病例中，NKAIN2經(jīng)常通過缺失及斷裂發(fā)生失活，并且通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明NKAIN2能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵

3、襲，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　鈉鉀泵在腫瘤中的作用已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注，很多研究發(fā)現(xiàn)其在多種腫瘤中活性增強(qiáng)，而鈉鉀泵抑制劑如強(qiáng)心苷等，已經(jīng)被證實(shí)對(duì)多種腫瘤包括前列腺癌有抑制作用，并且有些抑制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。
　　課題組前期發(fā)現(xiàn)NKAIN2在前列腺癌中發(fā)揮抑癌作用，而作為鈉鉀泵相互作用因子，推測(cè)其可能通過抑制鈉鉀泵發(fā)揮抑癌作用，并且在細(xì)胞水平上進(jìn)行探索和驗(yàn)證。
　　方法：
　　基于以上認(rèn)識(shí)，本研究首先通過west

4、ern blotting及鈉鉀泵活性試劑盒檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞系中鈉鉀泵α1和β1亞基的表達(dá)及鈉鉀泵活性，并通過免疫組化在前列腺癌組織標(biāo)本中檢測(cè)鈉鉀泵α1和β1亞基的表達(dá);運(yùn)用免疫共沉淀驗(yàn)證了NKAIN2與鈉鉀泵β1亞基的相互作用;運(yùn)用CRISPR/CAS9基因敲除技術(shù)，構(gòu)建Cas9/SgRNA質(zhì)粒慢病毒載體轉(zhuǎn)染22RV1細(xì)胞系(NKAIN2高表達(dá))，并通過Western blotting和Cruiser酶切敲除及突變檢測(cè)試劑盒檢測(cè)敲除效率

5、;進(jìn)一步通過裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)驗(yàn)證NKAIN2的抑癌作用，同時(shí)通過Western blotting檢測(cè)敲除NKAIN2后PI3K/Akt通路激活情況;接著在過表達(dá)、沉默NKAIN2的前列腺癌細(xì)胞系22RV1、PC-3中通過Western blotting及無機(jī)磷試劑盒檢測(cè)鈉鉀泵β1亞基的表達(dá)及鈉鉀泵活性，分析NKAIN2對(duì)鈉鉀泵的影響;并在前列腺癌細(xì)胞系22RV1、PC-3中沉默鈉鉀泵β1亞基，分析鈉鉀泵對(duì)前列腺癌生物學(xué)功能的影響。

6、r>　　結(jié)果：
　　1.本研究通過western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞系中鈉鉀泵α1和β1亞基的表達(dá)較前列腺永生化上皮細(xì)胞系增高;并通過免疫組化檢測(cè)了30對(duì)前列腺癌標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)鈉鉀泵α1和β1亞基在前列腺癌組織中較癌旁組織表達(dá)增高;鈉鉀泵活性檢測(cè)試劑盒同樣發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞系鈉鉀泵活性較前列腺永生化上皮細(xì)胞系增強(qiáng)。
　　2.Western blotting和Cruiser酶檢測(cè)結(jié)果鑒定22RV1NKAIN2敲除細(xì)

7、胞株構(gòu)建成功，進(jìn)一步裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)提示NKAIN2敲除細(xì)胞系成瘤體積明顯較對(duì)照組增大，并且發(fā)現(xiàn)敲除NKAIN2后激活PI3K/Akt通路。
　　3.在PC-3及22RV1細(xì)胞中，過表達(dá)NKAIN2能抑制鈉鉀泵β1亞基的表達(dá)，相反沉默NKAIN2能增強(qiáng)鈉鉀泵β1亞基的表達(dá)。
　　4.在PC-3及22RV1細(xì)胞中，過表達(dá)NKAIN2能抑制鈉鉀泵活性，相反沉默NKAIN2能增強(qiáng)鈉鉀泵的活性。
　　5.在PC-3及22RV1細(xì)胞