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文檔簡介
1、前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一,在腫瘤中死亡率居于第六位,全世界每年大約有903,500個(gè)新增病例,其中258,400人死亡。近年來,隨著診斷技術(shù)的提高,篩選程序的有效開展,在包括中國等亞歐國家中,前列腺癌發(fā)病率均呈上升趨勢??剐奂に丿煼ㄔ谥委煶跗诖_實(shí)起到了一定的效果,但隨著治療的進(jìn)行,患者在幾年內(nèi)不可避免地對激素治療發(fā)生抵抗,即去勢抵抗性前列腺癌。對于這種對內(nèi)分泌治療不敏感的激素非依賴性前列腺癌,始終沒有較理想的治療方法,已日益成
2、為臨床亟待解決的難題。
PI3K/Akt/mTOR信號通路是前列腺癌的一個(gè)重要治療靶點(diǎn),哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR是一種進(jìn)化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶,從屬于PI3K家族成員,是PI3K/Akt信號通路的下游效應(yīng)器。mTOR廣泛表達(dá)于細(xì)胞中,調(diào)控著不同細(xì)胞包括存活、增殖在內(nèi)的多項(xiàng)細(xì)胞功能。其中,mTORC1一方面接受細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)著包含5'末端(TOP)mRNAs的翻譯,另一方面充當(dāng)調(diào)控帽依賴RNA翻譯起始的級聯(lián)信號通
3、路的中樞。4E-BP1是mTOR下游的關(guān)鍵信號蛋白,也是蛋白質(zhì)合成中的負(fù)向調(diào)控因子,它可抑制eIF-4G與eIF-4E的結(jié)合,最終抑制蛋白質(zhì)翻譯的起始過程。當(dāng)4E-BP1被mTOR磷酸化后,從eIF-4E解離下來,eIF-4E去抑制,eIF-4E從而與eIF-4A、eIF-4G結(jié)合,形成eIF-4F復(fù)合物,并與mRNA帽結(jié)合,啟動帽依賴性的蛋白質(zhì)翻譯起始。同時(shí),mTORC1還可以磷酸化p70核糖體蛋白S6激酶(p70S6K),從而磷酸化
4、S6蛋白的小核糖體亞基,與其他激酶一起促進(jìn)蛋白翻譯。在前列腺癌和其它多種實(shí)體瘤中,mTOR是與腫瘤生成和治療抵抗均相關(guān)的關(guān)鍵蛋白。且在前列腺癌中,mTOR信號通路整合細(xì)胞存活相關(guān)信號,mTOR及其下游關(guān)鍵蛋白多處于活化狀態(tài)。
和細(xì)胞增殖一樣,細(xì)胞凋亡也是一個(gè)受多條信號通路多個(gè)基因調(diào)控的復(fù)雜過程,在受到有害或異常刺激時(shí),細(xì)胞通過凋亡進(jìn)行自我破壞以維持自體穩(wěn)態(tài),是一種保護(hù)性的生物學(xué)反應(yīng)。凋亡通路的失調(diào)可能通過促進(jìn)異常細(xì)胞的過度增殖
5、,最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生,所以凋亡信號通路是腫瘤治療的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。
川芎是一種中藥植物,藁本屬,傘形科,因其良好的促血液循環(huán)作用而頗受關(guān)注。川芎最主要的有效成分是川芎嗪(TMP,2,3,5,6-Tetramethylpyrazine),川芎嗪通過抗血小板聚集和調(diào)節(jié)微動脈小動脈可以改善微循環(huán),并且川芎還具有抗氧化,抗纖維化,以及鈣拈抗等作用。鹽酸川芎嗪已經(jīng)作為一種預(yù)防和治療血管疾病的藥物在臨床廣泛使用多年,且近年來研究顯示川芎嗪還
6、有抑制腫瘤生長、多藥耐藥、遷移等多重抗腫瘤效應(yīng)。
本研究中,我們首先用MTT比色法觀察鹽酸川芎嗪對前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖的影響,然后對鹽酸川芎嗪抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖作用的機(jī)理進(jìn)行了探討:(1)通過Western Blot檢測mTOR信號通路關(guān)鍵蛋白mTOR、p70S6K、S6、eIF4E和4E-BP1的磷酸化表達(dá),且通過7-甲基-GTP Pull down繼續(xù)探討鹽酸川芎嗪對前列腺癌PC-3細(xì)胞翻譯起始蛋白表達(dá)的影響
7、,最后通過LUC熒光素酶證實(shí)PC-3細(xì)胞蛋白合成率變化;(2)采用流式細(xì)胞術(shù)和Hochest33342染核觀察細(xì)胞凋亡情況,以及western blot觀察凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。這些研究將為鹽酸川芎嗪治療腫瘤提供理論基礎(chǔ)和支持。
方法:
1.0、0.6、1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2、8.4mM的鹽酸川芎嗪刺激前列腺癌PC-3細(xì)胞48h和72h,刺激人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞HCT-116和前列腺上皮細(xì)胞RWPE
8、-148h,MTT檢測鹽酸川芎嗪對其增殖能力的影響。
2.0、4.8、7.2mM的鹽酸川芎嗪刺激前列腺癌PC-3細(xì)胞48h:
(1)檢測對mTOR信號通路的影響Western Blot檢測 mTOR、p70S6K、S6、eIF4E和4E-BP1蛋白及蛋白磷酸化的表達(dá)(磷酸化刺激時(shí)間45min)。
7-甲基-GTP pulldown檢測4EBP1和eIF4E蛋白表達(dá)(刺激時(shí)間為24h)。
LUC熒光
9、素酶檢測細(xì)胞蛋白合成率變化。
RT-PCR檢測熒光素酶基因的變化。
(2)檢測對凋亡的影響流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況.
Hochest33342染核后熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變。
Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。
3.數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS17.0)處理,組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD檢驗(yàn)。
結(jié)果:
1.0、
10、0.6、1.2、2.4、3.6、4.8、6.0、7.2、8.4mM的鹽酸川芎嗪刺激前列腺癌PC-3細(xì)胞、人結(jié)腸直腸癌HCT-116細(xì)胞,和前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞后,PC-3和HCT-116兩種腫瘤細(xì)胞增殖明顯受抑制(p<0.05),且PC-3細(xì)胞呈濃度和時(shí)間依賴性(p<0.05),而RWPE-1增殖無明顯影響(p>0.05,MTT檢測)。
2.4.8mM和7.2mM的鹽酸川芎嗪
(1)對mTOR信號通路的影響明顯
11、抑制mTOR及其下游關(guān)鍵蛋白(p70S6K、S6、eIF4E、4E-BP1)的磷酸化(p<0.01),而這些蛋白本身的表達(dá)水平無明顯變化(p>0.05,western blot檢測)。
明顯上調(diào)4E-BP1與eIF4E的結(jié)合,下調(diào)eIF4E的表達(dá)(p<0.05,7-甲基-GTP Pulldown檢測)。
明顯抑制Luciferase報(bào)告基因的表達(dá)(p<0.05,LUC熒光素酶檢測),但其Luciferase mRNA
12、水平無明顯變化(p>0.05,RT-PCR檢測)。
(2)對凋亡的影響促進(jìn)前列腺癌PC-3細(xì)胞的凋亡(p<0.05,流式細(xì)胞術(shù))誘發(fā)前列腺癌PC-3細(xì)胞核的形態(tài)改變(Hochest33342染核,熒光顯微鏡觀察)。
上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase-3表達(dá)(p<0.05),下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)(p<0.05,western blot檢測)。
結(jié)論:
鹽酸川芎嗪對前列腺癌PC-3細(xì)胞
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