Amycolatopsis alba DSM44262中ansacarbamitocins的生物合成研究.pdf

1、美登素類化合物(maytansinoids)是一類以3-氨基-5-羥基苯甲酸(AHBA)為起始單元，由Ⅰ型聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)合成的19元大環(huán)內(nèi)酰胺類安莎霉素，具有很好的抗菌和抗腫瘤活性。基于美登素的抗體偶聯(lián)藥物adotrastuzumab entansine(商品名Kadcyla)已經(jīng)被批準用于HER2陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療，此外，尚有10余種偶聯(lián)該類毒素的抗體偶聯(lián)藥物正處于臨床研究階段。美登素類

2、抗體偶聯(lián)藥物合成的核心前體美登醇(maytansinol)目前是由微生物發(fā)酵得到的安絲菌素類(ansamitocins)在體外經(jīng)半合成制備而成，但該方法存在成本高、產(chǎn)率低、副產(chǎn)物不易分離除去等缺點，不利于美登素類抗體偶聯(lián)藥物的研究和生產(chǎn)。因此，尋找新的美登醇替代來源具有重要意義。
　　前期，本實驗室從白色擬無枝酸菌Amycolatopsis alba DSM44262中分離鑒定了5個美登素衍生物ansacarbamitocins(

3、1-5)。我們通過對DSM44262菌株基因組序列的生物信息學分析，定位了ansacarbamitocins的合成基因簇abm。通過與已報道的安絲菌素合成基因簇比較，發(fā)現(xiàn)abm基因簇含有2個氨甲?；D(zhuǎn)移酶基因abm21a和abm21b，及1個N-糖基轉(zhuǎn)移酶的基因abm25，推測它們可能分別負責ansacarbamitocins C3和C7位羥基的氨甲酰化，及ansacarbamitocins的N-糖基化。因此，有望通過敲除負責C3位羥基

4、氨甲酰化的基因及abm25獲得美登醇類似物。
　　為此，我們首先建立了A.alba DSM44262的菌絲體電轉(zhuǎn)化遺傳操作體系;然后分別對abm21a、abm21b和abm25進行了體內(nèi)敲除。通過對abm21a和abm21b敲除突變株積累中間產(chǎn)物的分離鑒定，發(fā)現(xiàn)2株敲除突變株積累的中間產(chǎn)物相同，即積累了大量的19-chloroproansamitocin和少量的14-OH-19-chloroproansamitocin,從而推測a

5、bm21a和abm21b可能共同參與ansacarb amitocins中C3和C7位羥基的氨甲?；?。通過對abm25敲除突變株積累中間產(chǎn)物的分離鑒定，獲得了N-deglucosyl-ansacarbamitocin A，表明abm25參與了ansacarbamitocins的N-糖基化。
　　此外，由于抗生素類N-糖基轉(zhuǎn)移酶難以獲得可溶性重組蛋白，限制了其體外功能研究，因此，我們開展了abm25的體外研究。對abm25基因進行了

6、系統(tǒng)的異源表達條件摸索，最終獲得了可溶且有活性的His-SUMO-Abm25融合蛋白，這是首次獲得的可溶且有活性的N-糖基轉(zhuǎn)移酶。通過測定不同pH值和溫度對Abm25酶活的影響，發(fā)現(xiàn)Abm25的最適pH為8.0，最適反應溫度為37℃。接著，我們進一步測定了Abm25的動力學參數(shù)，在UDP-葡萄糖500μM的條件下，19-chloroproansamitocin對應的Km為2.44±0.26μM，kcat為0.24±±0.01 min-1

7、;在19-chloroproansamitocin400μM的條件下，UDP-Glc對應的Km為10.22±1.36μM，kcat為0.15±0.01 min-1。與此同時，還開展了Abm25的底物廣譜性研究，發(fā)現(xiàn)Abm25對于糖受體具有嚴格的專一性，糖供體除UDP-葡萄糖外還可利用UDP-葡萄糖醛酸，豐富了抗生素類N-糖基轉(zhuǎn)移酶工具酶庫。
　　本研究鑒定了白色擬無枝酸菌DSM44262中的ansacarbamitocins合成基