釀酒酵母中水楊酸生物合成研究.pdf

1、釀酒酵母這個具有代表性的真核生物模型，近年來在生物合成、生物發(fā)酵領(lǐng)域越來越受到人們的青睞。水楊酸是一種在工業(yè)上具有廣泛應(yīng)用的中間體，如何實(shí)現(xiàn)綠色生產(chǎn)具有極大的研究價(jià)值。本研究利用合成生物學(xué)的方法，在釀酒酵母中引入水楊酸合成基因，通過基因工程手段提高釀酒酵母中水楊酸的產(chǎn)量。具體工作如下:
　　1、在釀酒酵母BY4741中引入外源基因entC和PfpchB，成功表達(dá)并催化反應(yīng)生成水楊酸。優(yōu)化啟動子，改變外源基因表達(dá)，構(gòu)建質(zhì)粒181-P

2、GI1-EP,181-TEF2-EP,181-TEF1-EP。重組菌BY4741-181-TEF1-EP，水楊酸產(chǎn)量最高達(dá)到12.06±0.38mg·L-1。
　　2、對釀酒酵母莽草酸途徑進(jìn)行改造，解除關(guān)鍵酶Aro4的反饋抑制，并優(yōu)化啟動子構(gòu)建質(zhì)粒181-PGI1-EPA，181-TEF2-EPA，181-TEF1-EPA。重組釀酒酵母BY4741-181-TEF1-EPA水楊酸發(fā)酵產(chǎn)量最高達(dá)到33.2±0.3mg·L-1。整合替

3、換Aro1基因啟動子為TEF1p，重組菌BY4741-TEF1p-Aro1-181-TEF1-EPA水楊酸發(fā)酵產(chǎn)量為7.76±0.41mg·L-1。
　　3、在釀酒酵母中異源表達(dá)大腸桿菌莽草酸途徑相關(guān)酶，分三個模塊構(gòu)建質(zhì)粒:模塊一181-TEF1-EPAC，195-AroC;模塊二195-AL;模塊三195-BDE;模塊二模塊三聯(lián)合構(gòu)建195-ALBDE。其中模塊三發(fā)酵48h水楊酸產(chǎn)量最高為41.68±1.92mg·L-1。

4、>　　4、在釀酒酵母中，過表達(dá)磷酸戊糖途徑上的基因，構(gòu)建了單基因過表達(dá)質(zhì)粒195-ZWF1，195-SOL3，195-GND1，195-TKL1，195-TAL1，和多基因過表達(dá)質(zhì)粒195-ZWF1-SOL3，195-SOL3-GND1，195-ZWF1-GND1，195-TKL1-TA L1，195-ZWF1-SOL3-GND1。單基因過表達(dá)GND1水楊酸產(chǎn)量最高46.71±0.27mg·L-1。多基因過表達(dá)中，ZWF1和GND1共表