基于甘草次酸修飾自組裝膠束遞藥系統(tǒng)的研究.pdf

1、目前，針對(duì)肝癌的臨床治療，化學(xué)療法依然占據(jù)著重要的地位。然而，傳統(tǒng)的化學(xué)治療藥物在通過(guò)全身給藥獲得治療效果的同時(shí)，也會(huì)因藥物非特異性分布而引發(fā)嚴(yán)重的毒副作用，長(zhǎng)期應(yīng)用還有引發(fā)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥效應(yīng)，降低療效。納米靶向給藥系統(tǒng)是近年來(lái)抗腫瘤藥物遞送領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，它通過(guò)載體材料將藥物包裹或分散于納米級(jí)的基質(zhì)當(dāng)中，選擇性將治療藥物遞送到病灶部位，降低藥物的非特異性分布，在增強(qiáng)藥物療效、降低毒副作用的同時(shí)，且具有一定的逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的能力

2、。其中，聚合物自組裝膠束作為納米藥物載體，在改善難溶性藥物的溶解性的同時(shí)，可以有效地改善藥物體內(nèi)組織分布，提高藥物的生物利用度，并實(shí)現(xiàn)持續(xù)、緩慢的藥物釋放。在聚合物自組裝膠束的設(shè)計(jì)中通過(guò)化學(xué)修飾偶聯(lián)肝靶向配體甘草次酸(GA)可實(shí)現(xiàn)藥物的肝主動(dòng)靶向遞送，提高藥物遞送效率。
　　本論文通過(guò)兩種不同的設(shè)計(jì)策略構(gòu)建了兩種新型的肝靶向聚合物載體材料，在實(shí)現(xiàn)藥物肝主動(dòng)靶向遞送的同時(shí)，并探究了甘草次酸修飾在自組裝載藥膠束遞藥行為中的作用。第一種

3、設(shè)計(jì)策略以O(shè)-羧甲基殼聚糖(OCMC)為水溶性骨架，首先通過(guò)偶聯(lián)膽酸(CA)對(duì)OCMC進(jìn)行疏水性修飾獲得兩親性O(shè)-羧甲基殼聚糖-膽酸聚合物(CMCA)，然后將甘草次酸(GA)通過(guò)其C-3位羥基以丁二酸酐為連接臂偶聯(lián)到聚合物上，并對(duì)最終的聚合物進(jìn)行堿化處理，獲得甘草次酸修飾的羧甲基殼聚糖-膽酸聚合物(GA-CMCA)。以CMCA和GA-CMCA為載體，以槲皮素(QC)為模型藥物制備載藥膠束，研究其理化性質(zhì)、體外釋藥、體外抗腫瘤活性以及體內(nèi)

4、藥物動(dòng)力學(xué)特征。另以阿霉素(DOX)為抗腫瘤模型藥物驗(yàn)證CMCA和GA-CMCA的載藥能力，考察其理化性質(zhì)、體外攝取、體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征、體內(nèi)組織分布以及體內(nèi)外抗腫瘤活性，評(píng)估所構(gòu)建聚合物膠束系統(tǒng)的肝靶向遞藥能力和抗腫瘤效果。本論文第二種設(shè)計(jì)策略以低分子肝素(LMWH)為水溶性骨架材料，首先將甘草次酸通過(guò)其C-3位羥基以丁二酸酐為連接臂修飾到氨基化的LMWH骨架上得到甘草次酸修飾的LMWH(LMWH-GA)，進(jìn)而將水溶性肝靶向小分子乳糖酸(

5、LA)偶聯(lián)到聚合物上獲得雙配體修飾的LMWH(LA-LMWH-GA)。利用GA分子的疏水作用力構(gòu)建自組裝膠束體系，以DOX為模型藥物，考察水溶性乳糖酸修飾對(duì)載藥膠束理化性質(zhì)、載藥與釋藥、體外攝取、體外抗腫瘤活性、體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征以及體內(nèi)組織分布的影響，并通過(guò)對(duì)比設(shè)計(jì)策略一中GA-CMCA的藥物遞送行為，分析并探討甘草次酸修飾在聚合物自組裝藥物遞送系統(tǒng)中的作用，為基于甘草次酸修飾的自組裝遞藥系統(tǒng)設(shè)計(jì)、提高藥物肝靶向遞送能力提供可借鑒的新思路

6、。
　　本論文的主要研究?jī)?nèi)容及相關(guān)結(jié)果概括如下:
　　1.利用鹽酸降解法獲得分子量為17 KDa的OCMC，并以其為水溶性骨架，合成了基于OCMC的兩親性聚合物CMCA和GA-CMCA，核磁共振氫譜、紅外光譜以及X射線衍射驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)，紫外分光光度法測(cè)定CMCA中CA的取代度以及GA-CMCA中GA的取代度。采用超聲法制備空白自組裝膠束，透射電鏡(TEM)觀察自組裝膠束形態(tài)，測(cè)定粒徑、Zeta電勢(shì)以及臨界膠束濃度(CMC)。并

7、通過(guò)考察空白膠束的體外細(xì)胞毒性初步評(píng)估所構(gòu)建膠束的安全性。結(jié)果表明，所合成的CMCA和GA-CMCA聚合物可在水介質(zhì)中自組裝形成大小均一的球形粒子。CMCA膠束的平均水化粒徑為110～257 nm，荷有恒定的負(fù)電荷(～-20mV)，芘熒光探針?lè)y(cè)定其CMC值為0.028～0.079 mg/ml。隨著CA取代度的增加，粒徑和CMC均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，但表面Zeta電位無(wú)明顯變化。選用CA取代度為8.2％的CMCA進(jìn)行GA進(jìn)一步修飾，偶聯(lián)GA

8、后的GA-CMCA空白膠束的粒徑和CMC值有變大的趨勢(shì)，表面Zeta電位有所降低。研究選用GA取代度為6.5％的GA-CMCA進(jìn)行后續(xù)評(píng)估?；酋Ａ_丹明B(SRB)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CMCA和GA-CMCA均具有較低的細(xì)胞毒性，僅在高濃度時(shí)(＞0.25 mg/ml)，GA-CMCA才顯示出不可忽略的細(xì)胞增殖抑制作用。
　　2.以QC為模型藥物一，用改良的超聲-透析法制備載藥膠束。在相同藥物/載體質(zhì)量比下，GA-CMCA顯示出比CMCA更強(qiáng)

9、的藥物包封能力，所制備的QC/GA-CMCA表現(xiàn)出相對(duì)較小的粒徑和粒徑分布。當(dāng)藥物/載體比為1∶5時(shí)， GA-CMCA對(duì)QC的包封率和載藥量分別可達(dá)56.94％和9.69％，相應(yīng)QC/GA-CMCA的平均粒徑為185.5 nm，粒徑多系分散系數(shù)PDI為0.130。而CMCA對(duì)QC的包封率和載藥量?jī)H為47.03％和8.32％，平均粒徑和PDI分別為211.4 nm和0.171。載藥膠束的體外釋放結(jié)果顯示QC/CMCA和QC/GA-CMCA

10、均表現(xiàn)出持續(xù)、緩慢、pH響應(yīng)型的釋藥行為。當(dāng)釋放介質(zhì)pH值由7.4降低到6.5時(shí)，兩種載藥膠束的釋放速度和累計(jì)藥物釋放量均顯著增加，其中QC/GA-CMCA的釋藥速度和累計(jì)釋藥量增加更為顯著。當(dāng)釋放介質(zhì)pH值進(jìn)一步降低到5.7時(shí)，QC/CMCA的釋藥速度和累計(jì)釋藥量進(jìn)一步增加，而QC/GA-CMCA膠束則在釋放介質(zhì)中出現(xiàn)明顯聚集沉淀，而QC也隨著聚合物沉淀而析出，導(dǎo)致了緩慢的無(wú)突釋現(xiàn)象的藥物釋放。為探究QC/CMCA和QC/GA-CMC

11、A對(duì)環(huán)境pH值降低敏感性差異的原因，研究進(jìn)一步考察了兩種載藥膠束在不同pH值中的Zeta電位變化，結(jié)果表明QC/CMCA和QC/GA-CMCA的Zeta電位均隨著pH值的降低而降低，且QC/GA-CMCAZeta電位值降低的速度要顯著快于QC/CMCA。體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞中QC/GA-CMCA膠束顯示出比QC/CMCA和QC溶液更強(qiáng)的細(xì)胞毒性和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。此外，大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果表明，QC/CMCA和Q

12、C/GA-CMCA均可以顯著提高QC在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，降低藥物清除率，其藥-時(shí)曲線下面積AUC0-∞分別為QC溶液組的4.9倍和7.4倍。
　　3.以抗腫瘤藥物DOX為模型藥物二，對(duì)CMCA和GA-CMCA的藥物包封和遞送能力進(jìn)行驗(yàn)證。采用透析法在不同藥物/載體質(zhì)量比下制備載藥膠束，CMCA和GA-CMCA的載藥量隨著投藥量的增加而增大，但包封率呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，尤其以DOX/CMCA的包封率降低更為明顯。當(dāng)藥物/載體質(zhì)量比為3∶1

13、0時(shí)，GA-CMCA對(duì)DOX的包封率為71.25％，而CMCA對(duì)DOX的包封率僅為63.41％，說(shuō)明GA-CMCA對(duì)DOX具有更強(qiáng)的包載能力，表明在載藥膠束的自組裝過(guò)程中，GA會(huì)以疏水形式參與到疏水內(nèi)核的形成中，增強(qiáng)膠束內(nèi)核的作用力，加強(qiáng)對(duì)疏水藥物的包封。綜合考慮包封率和載藥量指標(biāo)，選用藥物/載體質(zhì)量比為1∶5情況下制備的載藥膠束進(jìn)行后續(xù)評(píng)價(jià)，測(cè)定兩種載藥膠束平均粒徑均在200 nm左右，且荷有恒定的負(fù)電荷(～-17mV)。細(xì)胞攝取結(jié)果

14、顯示，DOX/CMCA和DOX/GA-CMCA膠束可以顯著提高DOX在耐藥HepG2/ADR細(xì)胞中的攝取，且DOX/GA-CMCA膠束作用更為突出。HepG2/ADR細(xì)胞中的競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在大量游離甘草次酸存在的情況下，DOX/GA-CMCA的攝取被顯著抑制，說(shuō)明DOX/GA-CMCA進(jìn)入細(xì)胞與甘草次酸介導(dǎo)的內(nèi)吞作用有關(guān)。而在HepG2細(xì)胞中，兩種載藥膠束的攝取均低于DOX溶液，這也間接表明DOX/CMCA和DOX/GA-CMC

15、A在HepG2/ADR細(xì)胞中是通過(guò)逆轉(zhuǎn)多藥耐藥而達(dá)到提高DOX在胞內(nèi)聚集目的的。胞內(nèi)DOX分布結(jié)果揭示孵育游離DOX溶液之后，在HepG2細(xì)胞中，DOX可以快速的濃集于細(xì)胞核附近，且隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)熒光顯著增強(qiáng)，而在耐藥HepG2/ADR細(xì)胞中則點(diǎn)狀零星的分布于細(xì)胞質(zhì)中，且孵育2h和6h熒光強(qiáng)度并未發(fā)生明顯變化。而HepG2細(xì)胞和HepG2/ADR細(xì)胞在經(jīng)過(guò)DOX/CMCA和DOX/GA-CMCA膠束孵育后，均在細(xì)胞質(zhì)中看到大量的DOX

16、聚集，且隨著孵育時(shí)間的增長(zhǎng)逐漸釋放到細(xì)胞質(zhì)中。這說(shuō)明DOX膠束制劑進(jìn)入HepG2細(xì)胞和HepG2/ADR細(xì)胞后均存在緩慢、持久的藥物釋放行為。
　　4.以HepG2和HepG2/ADR為細(xì)胞模型，考察了DOX載藥膠束的體外抗腫瘤效果，并探討了DOX載藥膠束逆轉(zhuǎn)耐藥腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的能力。結(jié)果表明DOX/CMCA和DOX/GA-CMCA膠束均可以因其疏水內(nèi)核對(duì)DOX的保護(hù)作用部分逆轉(zhuǎn)HepG2/ADR細(xì)胞的多藥耐藥性，其多藥耐藥逆轉(zhuǎn)

17、指數(shù)分別為1.45和1.87。相反，在非耐藥HepG2細(xì)胞中，DOX溶液具有最高的細(xì)胞增殖抑制作用，而DOX包封于CMCA和GA-CMCA后，其細(xì)胞毒性作用有所降低，這與DOX載藥膠束緩慢的胞內(nèi)釋放有關(guān)。
　　5.分別以Wistar大鼠和昆明種小鼠為動(dòng)物模型，以DOX溶液為對(duì)照，考察DOX/CMCA和DOX/GA-CMCA在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為和組織分布特征。結(jié)果表明DOX/CMCA和DOX/GA-CMCA均能夠顯著延長(zhǎng)DOX在大鼠血

18、液循環(huán)中的時(shí)間，且DOX/GA-CMCA的效果更為明顯。靜脈注射DOX/GA-CMCA后的藥-時(shí)曲線下面積AUC0-∞是注射DOX/CMCA后AUC0-∞值的3.1倍，且其清除率僅為DOX/CMCA組清除率CL值的1/3。小鼠組織分布結(jié)果顯示，DOX/GA-CMCA膠束制劑在肝中的分布要顯著高于DOX溶液組和DOX/CMCA組，且在同時(shí)間點(diǎn)DOX/GA-CMCA膠束在肝中的分布明顯高于在其他組織中的分布。定量靶向性分析結(jié)果表明，DOX/

19、GA-CMCA膠束具有較強(qiáng)的肝靶向性，以DOX溶液組為對(duì)照，其在肝、脾、心、肺、腎中24 h的相對(duì)攝取率Re值分別為3.50，1.04，0.18，0.04和0.69，可見(jiàn)經(jīng)過(guò)GA-CMCA包載在顯著提高DOX在肝臟部位聚集的同時(shí)，可有效減少DOX在非靶器官，尤其是心、肺中的非特異性分布，降低藥物遞送毒副作用，這對(duì)提高患者依從性具有重要的臨床意義。
　　6.以H-22肝癌荷瘤小鼠為動(dòng)物模型，以生理鹽水和DOX溶液為對(duì)照研究DOX/C

20、MCA和DOX/GA-CMCA的體內(nèi)抗腫瘤效果，結(jié)果表明，DOX/CMCA和DOX/GA-CMCA可顯著提高DOX的體內(nèi)抑瘤效果，其中GA修飾的DOX/GA-CMCA對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用更為顯著。此外，空白材料GA-CMCA也顯示出一定的體內(nèi)抑瘤效果，這與甘草次酸本身的抗腫瘤活性有關(guān)。
　　7.與策略一中首先構(gòu)建兩親性CMCA聚合物從而進(jìn)一步考察GA修飾對(duì)藥物遞送的影響不同的是，策略二中首先利用GA的疏水性進(jìn)行聚合物的自組裝，并進(jìn)

21、一步考察水溶性LA修飾對(duì)載藥膠束藥物遞送的影響。該研究以分子量為4.5 KDa的LMWH為水溶性骨架，合成了LMWH-GA和LA-LMWH-GA，核磁共振氫譜及紅外光譜驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)，并根據(jù)1HNMR中氫原子歸屬計(jì)算LMWH-GA中的GA取代度，元素分析方法確定LA-LMWH-GA中的LA取代度。超聲法制備空白自組裝膠束，TEM觀察其表面形態(tài)，測(cè)定粒徑、Zeta電勢(shì)以及臨界膠束濃度。結(jié)果表明，兩種聚合物均可以在水介質(zhì)中自組裝成均一的球形，測(cè)

22、定LWMH-GA膠束的粒徑為109～204nm，CMC值為0.010～0.057 mg/ml，且荷有明顯的負(fù)電荷(～35 mV)。選用GA取代度分別為7.47和8.94的LMWH-GA進(jìn)行LA修飾獲得LA取代度分別為6.32和4.31的LA-LMWH-GA。與相應(yīng)的LMWH-GA相比，LA-LMWH-GA的粒徑和CMC值明顯增大，且表面Zeta電位顯著降低(-22～-26 mV)。研究探討了聚合物空白膠束的表觀分子量與聚合物膠束粒徑之間

23、的關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)凝膠滲透色譜(GPC)測(cè)定的空白膠束的表觀分子量隨著膠束粒徑的增大而增大。溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LMWH-GA的溶血毒性隨著GA取代度的增加而增大，且呈現(xiàn)出濃度依賴性。而經(jīng)乳糖酸修飾后的LA-LMWH-GA的溶血毒性顯示出一定的下降。在所有實(shí)驗(yàn)濃度下，GA取代度為7.47的LMWH-GA和相應(yīng)的LA-LMWH-GA的溶血率均不高于5％，故該取代度下的LMWH-GA和LA-LMWH-GA可以安全的應(yīng)用于注射給藥。此外，SRB實(shí)驗(yàn)

24、結(jié)果表明，空白膠束對(duì)對(duì)HepG2和HepG2/ADR細(xì)胞均未產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒作用，可以安全的應(yīng)用于藥物遞送領(lǐng)域。
　　8.以阿霉素為模型藥物，探究LMWH-GA作為藥物載體在肝靶向藥物遞送過(guò)程中的特點(diǎn)以及進(jìn)一步水溶性LA修飾對(duì)這種遞送行為的影響。透析法在不同藥物/載體質(zhì)量比下制備載藥膠束。測(cè)定其平均粒徑為77～164 nm，Zeta電位為-17～-29 mV，與空白膠束的粒徑和Zeta電位相比均有所降低。在相同藥物/載體質(zhì)量比下，

25、LMWH-GA對(duì)DOX顯示出比LA-LMWH-GA更強(qiáng)的藥物包載能力。當(dāng)藥物/載體質(zhì)量比為3∶10時(shí)，LMWH-GA對(duì)DOX的包封率可達(dá)70.3％，而LA-LMWH-GA對(duì)藥物的包載僅為58.44％，表明LA修飾降低了聚合物對(duì)疏水性藥物的包封能力。當(dāng)藥物/載體比為1∶10時(shí)，兩種載體材料對(duì)DOX的包封率最為接近，因此，在該項(xiàng)研究中，除細(xì)胞攝取及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)需對(duì)藥物/載體比特別考察外，其他評(píng)估實(shí)驗(yàn)中均采用藥物/載體比為1∶10制備的DOX

26、/LMWH-GA和DOX/LA-LMWH-GA載藥膠束進(jìn)行考察。兩種載藥膠束在體外均呈現(xiàn)出緩慢、持久、pH敏感型的藥物釋放行為:在pH=5.0酸性釋放介質(zhì)中的釋放量顯著高于在pH=7.4釋放介質(zhì)中的釋放量，這有利于膠束在腫瘤部位發(fā)生細(xì)胞毒性作用。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DOX/LMWH-GA和DOX/LA-LMWH-GA可以顯著提高DOX在耐藥細(xì)胞HepG2/ADR中的攝取，但雙靶向修飾的DOX/LA-LMWH-GA并未表現(xiàn)出其應(yīng)有的協(xié)同

27、作用，其攝取量低于DOX/LMWH-GA。競(jìng)爭(zhēng)抑制結(jié)果顯示DOX/LMWH-GA的攝取與甘草次酸介導(dǎo)的內(nèi)吞有關(guān);而DOX/LA-LMWH-GA既可以通過(guò)甘草次酸受體介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，又可以通過(guò)半乳糖受體介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，但甘草次酸受體的作用有所減弱。內(nèi)吞抑制結(jié)果表明DOX/LMWH-GA主要通過(guò)小窩蛋白途徑和巨型胞飲途徑兩種方式進(jìn)入細(xì)胞，而在DOX/LA-LMWH-GA的攝取中，這兩種入胞機(jī)制的作用均明顯減弱，而這可能是DOX/LA-LMWH-

28、GA攝取率低于DOX/LMWH-GA的原因。此外，為探究材料本身在藥物遞送方面的作用，研究對(duì)比考察了1∶10和1∶5兩種藥物/載體比制備的DOX/LMWH-GA和DOX/LA-LMWH-GA的細(xì)胞攝取行為，結(jié)果顯示1∶10藥物/載體質(zhì)量比制備的DOX膠束制劑比1∶5藥物/載體質(zhì)量比制備的DOX膠束在HepG2和HepG2/ADR兩種細(xì)胞中均顯示出更強(qiáng)的被細(xì)胞攝取的能力。SRB實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DOX包載于LMWH-GA和LA-LMWH-GA中

29、可顯著提高DOX對(duì)HepG2/ADR細(xì)胞的毒性，且DOX/LMWH-GA的毒性要高于DOX/LA-LMWH-GA。而在HepG2細(xì)胞中，游離DOX溶液具有最強(qiáng)的細(xì)胞殺傷作用，其在兩種細(xì)胞中的毒性差別間接說(shuō)明DOX/LMWH-GA和DOX/LA-LMWH-GA是通過(guò)逆轉(zhuǎn)HepG2/ADR細(xì)胞多藥耐藥性而增強(qiáng)對(duì)其細(xì)胞毒性作用的。此外，在較低的實(shí)驗(yàn)考察濃度下，1∶10藥物/載體質(zhì)量比制備的DOX膠束制劑比1∶5藥物/載體質(zhì)量比制備的DOX膠束

30、制劑毒性較低，而在較高的濃度下，1∶10藥物/載體質(zhì)量比制備的DOX膠束制劑則表現(xiàn)出較高的細(xì)胞增殖抑制作用。
　　9.Wistar大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DOX/LMWH-GA和DOX/LA-LMWH-GA均能夠提高DOX在體內(nèi)的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)DOX在血液循環(huán)中的存留時(shí)間，其中DOX/LMWH-GA的效果更為明顯。靜脈注射DOX/LMWH-GA和DOX/LA-LMWH-GA載藥膠束后的AUC0-∞值分別是注射DOX溶液組的22

31、.3倍和10.8倍，平均滯留時(shí)間則分別是DOX溶液組的8.2倍和6.5倍。小鼠體內(nèi)組織分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種載藥膠束，尤其是DOX/LMWH-GA可以顯著改善DOX在小鼠體內(nèi)的組織分布，高效的靶向于肝臟，并明顯降低在非靶器官尤其是心臟和肺中的分布，降低毒副作用，其在肝、心臟和肺中24h的相對(duì)攝取率Re值分別為3.23、0.10和0.05。而乳糖酸進(jìn)一步修飾的DOX/LA-LMWH-GA膠束制劑并未體現(xiàn)出更好的肝靶向作用，其在肝臟24 h的

32、相對(duì)攝取率Re值僅為DOX/LMWH-GA組的0.59倍，而在脾、心臟和肺中的非特異性分布則高于DOX/LMWH-GA組。這可能與LA水溶性修飾影響藥物包封能力、GA受體介導(dǎo)能力、以及DOX/LA-LMWH-GA較快的血液清除速率有關(guān)。
　　綜上所述，本研究通過(guò)不同設(shè)計(jì)策略所構(gòu)建的兩組新型GA修飾的自組裝膠束遞藥系統(tǒng)均可以有效包載疏水性藥物，且能夠通過(guò)主動(dòng)靶向提高藥物在肝臟部位的聚集，在增強(qiáng)治療效果的同時(shí)，減少藥物非特異性分布造成