新型載基因自組裝聚離子復合物膠束的研究.pdf

1、基因治療被認為對各種基因疾病如傳染病、與基因相關(guān)的紊亂和癌癥的治療具有巨大的潛力,因而受到廣泛關(guān)注。開發(fā)安全高效的基因運送載體是實現(xiàn)基因治療的關(guān)鍵之一。病毒載體轉(zhuǎn)染效率高,但其在體內(nèi)有一定的免疫原性和潛在的致癌性,使臨床應(yīng)用受到一定限制。非病毒載體易于制備、低毒、低免疫反應(yīng),安全性好但轉(zhuǎn)染效率較低。如何獲得高效的非病毒載體成為目前的研究熱點。
　　 在非病毒基因載體中,利用嵌段共聚物自組裝形成的聚離子復合物(polyioncom

2、plex,PIC)膠束,是目前廣泛應(yīng)用于基因藥物的一種非病毒載體。PIC膠束具有以下優(yōu)勢:①膠束的核能夠作為帶電化合物如DNA和酶的載體;②可選用生物可降解材料,安全性好;③納米級的粒徑且粒徑分布窄、體內(nèi)循環(huán)時間長;④制備簡單、制備過程都在水溶液中進行,避免了有機溶劑的使用和殘留;⑤易引入靶向因子等。因此本課題分別選擇兩嵌段共聚物PEG-b-PLL,三嵌段共聚物PLA-PEG-PLL,新型合成類脂-陽離子聚合物DOPE-g-PLL-b-

3、PEG作為載體材料,以增強型綠色熒光蛋白質(zhì)?；?pEGFP)作為報告基因,采用自組裝技術(shù)制備出三種不同類型的PIC膠束,其一是PEG-b-PLL/DNA自組裝形成PIC膠束;其二是PLA-PEG-PLL/DNA自組裝形成環(huán)狀PEG修飾(PEG loop)的PIC膠束;其三是合成了新型類脂-陽離子聚合物DOPE-g-PLL-b-PEG,并與DNA自組裝形成脂質(zhì)(lipid)修飾的PIC膠束。對三種PIC膠束分別進行理化性質(zhì)和生物學性質(zhì)評

4、價,以期篩選出低毒、安全、高效的基因載體,探索其作為基因載體的適用性和可行性。最后,以性質(zhì)優(yōu)良的DOPE-g-PLL-b-PEG為載體材料,DSPE-PEG-NH2提供活性基團,cNGR為靶向因子,制備cNGR主動靶向脂質(zhì)修飾PIC膠束,探討其作為靶向載基因自組裝聚離子復合物膠束的應(yīng)用前景。課題的主要研究方法與結(jié)果如下:
　　 一、PEG-b-PLL/DNA自組裝PIC膠束的研究
　　 本研究利用兩嵌段共聚物PEG-b-

5、PLL與DNA通過自組裝形成穩(wěn)定的納米復合物,即PIC膠束。透射電鏡觀察PIC膠束形態(tài);Zetasizer3000粒度分析儀測定其粒徑、粒度分布和zeta電位;并考察其抗核酸酶降解能力、血漿穩(wěn)定性、細胞毒性及其在HepG2細胞中的轉(zhuǎn)染情況。結(jié)果表明制備的PIC膠束外觀圓整,呈類球形,大小均勻,平均粒徑為150.3±5.5 nm,粒徑分布指數(shù)為0.226,zeta電位為10.4±1.2 mV。PIC膠束在血漿中穩(wěn)定,能保護DNA免受核酸酶

6、降解的能力,無顯著的細胞毒性,并能成功轉(zhuǎn)染HepG2細胞,但與PEI/DNA復合物相比,其轉(zhuǎn)染效率較低。在以后的研究中有待于進一步對其結(jié)構(gòu)進行改善以獲得更高的體外細胞轉(zhuǎn)染效率。
　　 二、PLA-PEG-PLL/DNA自組裝環(huán)狀PEG修飾PIC膠束的研究
　　 與前一部分PEG-b-PLL/DNA自組裝形成PIC膠束相比,本研究利用生物可降解三嵌段共聚物PLA-PEG-PLL為載體材料,增加了疏水PLA嵌段,旨在降低兩嵌

7、段共聚物的親水性。PLA-PEG-PLL與DNA自組裝形成環(huán)狀PEG修飾的PIC膠束:內(nèi)核為生物可降解材料PLA,起穩(wěn)定納米粒的作用;陽離子PLL壓縮DNA,沉積到PLA內(nèi)核上;PEG圍繞在納米粒周圍形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu),能更好的穩(wěn)定膠束體系。本部分選用PLA-PEG-PLL為材料,首先制備空白PLA-PEG-PLL納米粒,由于陽離子聚合物PLL本身帶正電荷,所得到的納米粒荷正電,其zeta電位可達28.0±2.4 mV。然后通過自組裝方式制

8、備PLA-PEG-PLL/DNA納米復合物,即環(huán)狀PEG修飾PIC膠束。該環(huán)狀PEG修飾PIC膠束呈球形或類球形,平均粒徑為127.4±6.7 nm,zeta電位為14.9±4.3 mV,抗核酸酶降解能力強、血漿穩(wěn)定性高,細胞存活率高,能夠?qū)⒕G色熒光蛋白基因成功的轉(zhuǎn)入HeLa和HcpG2細胞,且不受介質(zhì)中血清的影響,轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于PEI/DNA復合物。因此,利用生物可降解三嵌段共聚物PLA-PEG-PLL制備的環(huán)狀PEG修飾PIC膠束是一

9、種具有應(yīng)用潛力的非病毒基因載體。
　　 三、新型類脂-陽離子聚合物的合成及其自組裝脂質(zhì)修飾PIC膠束的研究
　　 疏水性的類脂材料DOPE能夠增強納米粒體系與內(nèi)吞體膜的融合,穿透溶酶體或內(nèi)涵體膜,增強基因轉(zhuǎn)染效率。為進一步增強PIC膠束的基因轉(zhuǎn)染效率,在PEG-b-PLL結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上引入具有膜融合磷脂特性的DOPE。PLL結(jié)構(gòu)中具備多個活性氨基基團可為DOPE提供修飾位點,因此本研究采用DCC/NHS反應(yīng)合成了新型類脂-陽

10、離子聚合物DOPE-g-PLL-b-PEG,并分別合成了高、中、低三批不同DOPE接枝修飾率的材料,其修飾率分別為16％,30％,56％,以考察不同接枝修飾率對轉(zhuǎn)染效率的影響。該類脂-陽離子聚合物與DNA通過電荷吸附作用自組裝形成載基因納米復合物,即脂質(zhì)修飾PIC膠束(Lipid modified PolyionComplex Micelle,LPCM):DNA和聚陽離子PLL,形成內(nèi)核,內(nèi)核由脂質(zhì)材料DOPE包覆,外層由親水性的聚合物

11、PEG包被。對其理化性質(zhì)、抗核酸酶降解能力、血漿穩(wěn)定性、細胞毒性及其在HepG2和HeLa細胞中的轉(zhuǎn)染情況分別進行了考察。結(jié)果表明制備的LPCM外觀圓整,呈類球形,大小均勻,粒徑在150nm左右。LPCM在血漿中穩(wěn)定,具有一定的抗核酸酶降解能力,細胞毒性低。在HepG2和HeLa細胞中,DOPE接枝修飾的聚合物比未修飾聚合物具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率(p＜0.05),DOPE接枝修飾率為30％的聚合物(LPCM30)顯示出最高的基因轉(zhuǎn)染效率

12、,在HeLa細胞中的轉(zhuǎn)染情況甚至優(yōu)于陽離子聚合物PEI。因此,新型類脂-陽離子聚合物作為基因載體,與DNA自組裝形成的脂質(zhì)修飾PIC膠束,制備工藝簡單,性能良好,綜合了聚合物與類脂的優(yōu)勢,是具有良好應(yīng)用前景的非病毒基因載體。
　　 四、cNGR主動靶向脂質(zhì)修飾PIC膠束的研究
　　 本文設(shè)計合成了類脂-陽離子聚合物,與DNA自組裝形成的脂質(zhì)修飾PIC膠束,取得了相對較低的毒性和較高的轉(zhuǎn)染效率,然而這種給藥體系仍然不具備主

13、動靶向特定細胞的能力。研究發(fā)現(xiàn),天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(asparagines-glycine-arginine,NGR)序列小肽可特異靶向腫瘤血管上皮細胞CD13受體,納米粒表面連接NGR肽后,與腫瘤新生血管上皮細胞過度表達的CD13受體特異結(jié)合,從而起到主動靶向和增強基因轉(zhuǎn)染效率的作用。因此,本研究以DOPE30-g-PLL-b-PEG和DSPE-PEG-NH2為載體,然后利用可特異靶向腫瘤血管上皮細胞CD13受體的環(huán)六肽CNGR

14、CG(cNGK)為靶向因子,制備載基因cNGR主動靶向LPCM(cNGR-LPCM)。對其相關(guān)理化性質(zhì),抗核酸酶降解的能力以及血漿穩(wěn)定性進行考察。通過體外細胞毒性試驗和基因轉(zhuǎn)染實驗對納米粒在HUVEC細胞,HepG2細胞中的細胞毒性和轉(zhuǎn)染效率進行初步評價。結(jié)果表明,所制備非靶向LPCM和cNGR-LPCM均呈球形或類球形,平均粒徑分別為134.4±6.1nm和139.5±7.6 nm,粒徑多分散指數(shù)分別0.214和0.132;zeta電

15、位分別為6.6±3.4 mV和7.0±3.8 mV。非靶向LPCM和cNGR-LPCM均具有較強的抗核酸酶能力和血漿穩(wěn)定性。體外細胞毒性實驗表明,在轉(zhuǎn)染劑量下,與PEI相比,cNGR-LPCM具有較低的細胞毒性(p＜0.05)。轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果表明,在CD13陽性細胞HUVEC中,cNGR-LPCM的體外轉(zhuǎn)染效率明顯高于在非靶向LPCM,而在CD13陰性HepG2細胞中,兩種LPCM沒有顯著差異(p＞0.05)。因此cNGR-LPCM具有較