纖維支架循環(huán)灌注式生物反應(yīng)器規(guī)?；囵B(yǎng)肝細胞的初步探討.pdf

1、急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是指無基礎(chǔ)肝臟疾病患者，在肝臟受到各種創(chuàng)傷后（物理、化學、生物性等），發(fā)生的肝功能損害或衰竭的急癥，其發(fā)病急，病程進展迅速，未加治療自然病程死亡率高達80％。目前尚無特效治療方法，內(nèi)科保守治療，患者死亡率仍高達50％以上，臨床最有效的治療方法是肝移植，但由于供肝的短缺，限制了肝移植的廣泛應(yīng)用。大部分急性肝衰竭的患者未能等到可移植肝源就已死亡，因此急切需要一種暫時可以替代肝臟功能

2、的機器，給予急性肝功能衰竭患者充足的時間過渡到肝移植狀態(tài)或肝細胞再生狀態(tài)，人工肝是治療肝衰竭患者的有效途徑，可在短時間內(nèi)達到部分或全部替代肝臟功能的目的，為急性肝衰竭患者贏得寶貴時間。
　　近十年來，人工肝研究取得了長足進展，從早期簡單的機械型人工肝進步至生物型人工肝，再到更為合理的混合型（機械+生物型）生物人工肝。生物反應(yīng)器作為生物人工肝的核心部分，主要包括：中空纖維型，結(jié)合微載體培養(yǎng)型，細胞球懸浮培養(yǎng)型等多種，但對于臨床治療所

3、要求的1010數(shù)量級細胞量，極少有生物反應(yīng)器能達到上述要求。
　　本課題組經(jīng)過多年的努力，研發(fā)了基于NASA微重力培養(yǎng)反應(yīng)器的微載體貼附懸浮式生物生物反應(yīng)器的人工肝支持系統(tǒng)原理機和商品化機器，并在大動物（西藏小型豬及食蟹猴）上進行驗證。為了進一步向臨床需求靠攏，在以上的基礎(chǔ)上研制纖維支架循環(huán)灌注式生物反應(yīng)器，以期達到臨床治療要求數(shù)量級的肝細胞，并在后續(xù)實驗中嘗試對108細胞進行培養(yǎng)，擴增至109-1010的肝細胞進行長達15d的培

4、養(yǎng)，并初步取得成功，其主要由纖維支架反應(yīng)罐，外置灌流系統(tǒng)，氧氣檢測系統(tǒng)，二氧化碳檢測系統(tǒng)，溫度控制系統(tǒng)，懸浮攪拌系統(tǒng)等構(gòu)成;其具有獨特的特點：①.逆重力式灌流，降低流體剪切力;②.外置循環(huán)灌注培養(yǎng)模式，增加液體交換效率;③.全自動氧氣、二氧化碳、酸堿度檢測調(diào)整系統(tǒng);④.體型變小，重量變輕，易于運輸。
　　第一章 纖維支架載體肝細胞生物相容性評價.
　　目的：
　　對纖維支架材料的構(gòu)成，理化性質(zhì)加以分析，完成對纖維支架循

5、環(huán)灌注式生物反應(yīng)器的設(shè)計及組裝，檢測纖維支架材料與肝細胞之間的生物相容性。
　　方法：
　　采用電鏡，X射線光電子能譜分析(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)等技術(shù)分析纖維支架材料特征，元素構(gòu)成，表面電荷及氨基酸分析纖維支架材料表面粘附氨基酸分子;通過高溫高壓(121℃，45min)，強酸(10％鹽酸，浸泡24h)強堿(10％碳酸氫鈉，浸泡24h)處理后通過電鏡觀察其表面性質(zhì)及破損情況

6、分析其穩(wěn)定性。在纖維支架載體上接種C3A細胞，并隨后采用Live/dead試劑盒細胞生長狀況進行評價。
　　結(jié)果：
　　纖維支架載體，此載體長10cm，寬1.13cm，為細胞提供接近11.3cm2貼附面積，電鏡下觀察纖維直徑均一，多層交叉，形成多種空隙，面積體積比大，可以提供較大細胞生長表面積。此支架主要成分為C，N，O分別74.32％，2.84％，22.84％，密度為ρ=0.2254mmol/g。支架表面攜帶賴氨酸，攜帶正

7、電荷，增強細胞粘附。在高溫，高壓，強酸，強堿處理后，纖維支架材料均呈現(xiàn)出穩(wěn)定狀態(tài)，電鏡下未觀察到纖維破裂、變形、融化等不良現(xiàn)象。細胞對纖維支架載體貼附良好，5d內(nèi)細胞活力維持大于90％，與對照組比較無顯著差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　纖維支架材料面積體積比大，高溫高壓強酸強堿處理后理化性質(zhì)穩(wěn)定，細胞帖附緊密生長旺盛，肝細胞與支架細胞相容性良好。
　　第二章 纖維支架循環(huán)灌注式生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)肝細胞.

8、>　　目的:
　　使用纖維支架循環(huán)灌注式生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)肝細胞，達到1010臨床治療要求水平，為新型生物人工肝系統(tǒng)提供可靠的生物反應(yīng)器部件。
　　方法:
　　按照說明調(diào)試機器，校準PH、溫度溶氧探頭，并提前預(yù)濕載體(600-700ml全培，37℃，2cm/s空轉(zhuǎn)24h;將108的C3A細胞量，并消化離心成50ml懸濁液，接種入反器，4H后取樣檢測細胞懸浮情況，隨后每日取樣進行臺盼藍染色、結(jié)晶紫染色、細胞計數(shù)，Q-P

9、CR、電鏡觀察;每日取培養(yǎng)基上清送檢葡萄糖、白蛋白、ALT、AST、乳酸。
　　結(jié)果:
　　細胞生長良好，在15d的培養(yǎng)中，細胞從1.07×108增長至約90-100×108個，結(jié)晶紫染色，染色面積逐漸增加，至15d載體面積貼附約為70％-80％，細胞活力維持在75％以上，ALT、AST漏出水平低，細胞損傷小，細胞基因表達水平較平板對照組顯著增高，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)細胞-細胞間連接增多。
　　結(jié)論:
　　纖維支架循環(huán)灌