長(zhǎng)鏈非編碼RNa-UFC1通過miR34a促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞減少及關(guān)節(jié)基質(zhì)破壞為主要病理特點(diǎn)很常見的退行性病變，骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重的患病者可導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能完全喪失。該病主要發(fā)生于中老年人群，是老年患者臨床最常見的關(guān)節(jié)類疾病，流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示我國(guó)40歲以上人群的OA患病率約為30％，65歲以上可達(dá)60％～70％。隨著我國(guó)社會(huì)人口老齡化問題的突出，該數(shù)據(jù)仍繼續(xù)在不斷提升中，已成為越來越備受關(guān)注的社會(huì)問題。目前，

2、該病尚無明確且有效的根治性的治療手段，臨床上采取的治療手段主要以控制疼痛、改善關(guān)節(jié)的功能和提高生活質(zhì)量為主要目的，首選藥物及理療等保守療法，當(dāng)保守治療無效時(shí)，可行關(guān)節(jié)鏡下關(guān)節(jié)清理、軟骨移植和關(guān)節(jié)置換等外科療法。新的流行病學(xué)證據(jù)表明OA的發(fā)生與發(fā)展除了與年齡直接相關(guān)以外，還受到諸多可調(diào)節(jié)因素的影響，具有可預(yù)防和可治療性。鑒于其病理進(jìn)程較為復(fù)雜，涉及到的機(jī)制也具有多樣化特征，針對(duì)OA的不同病理進(jìn)程及其相關(guān)機(jī)制，一些新的治療方案，如軟骨細(xì)胞移

3、植術(shù)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植術(shù)、基質(zhì)誘導(dǎo)自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)等已部分進(jìn)行了臨床開展，并獲得了一些效果，但仍不是十分理想。是以更深入研究OA的病理機(jī)制，挖掘更為確切的防治靶點(diǎn)，仍然是當(dāng)前需要解決的一個(gè)難題。
　　長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non coding RNA，Lnc RNA)是非編碼RNA的一個(gè)亞類，長(zhǎng)度超過200nt，較編碼RNA具有更強(qiáng)的組織特異性和細(xì)胞特異性，在不同細(xì)胞、組織及其不同發(fā)育階段，表達(dá)均有不同，與多種疾病的發(fā)

4、生與發(fā)展密切相關(guān)。部分學(xué)者指出Lnc RNA在OA發(fā)病過程中介導(dǎo)重要機(jī)制，并通過基因芯片與高通量DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)在軟骨分化過程中有2166個(gè)Lnc RNA表達(dá)上調(diào)，1472個(gè)Lnc RNA表達(dá)下調(diào)，為OA的臨床治療提供了新的希望。目前，關(guān)于LncRNA在OA的作用已有較多研究，但病理學(xué)方面仍然有許多未知之處需深入探索。在既往的前期研究工作中也發(fā)現(xiàn)OA患者軟骨細(xì)胞的LncRNA-UFC1表達(dá)水平低于正常軟骨細(xì)胞。在腫瘤性疾病中，UFC1

5、能通過與miR-34a特異性結(jié)合而抑制其活性，解除miR-34a對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。miR-34a過表達(dá)同時(shí)也是OA患者軟骨細(xì)胞凋亡和再生障礙的一個(gè)重要誘因，但在OA中，UFC1是否能夠與miR-34a特異性結(jié)合，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖尚不得知。
　　本研究分三部分內(nèi)容，首先觀察Lnc-RNA-UFC1對(duì)關(guān)節(jié)炎性海綿狀軟骨細(xì)胞增殖與凋亡行為的影響，分析Lnc-RNA-UFC1在OA病理機(jī)制的是否發(fā)揮了重要作用，確立其研究?jī)r(jià)值;其次

6、從Lnc-RNA-UFC1與miR-34a相互調(diào)控的角度分析其作用途徑，確定Lnc-RNA-UFC1對(duì)OA病理機(jī)制介導(dǎo)是否是通過miR-34a來完成的;最后選取miR-34a調(diào)節(jié)OA的相關(guān)下游信號(hào)分子，對(duì)Lnc-RNA-UFC1通過miR-34a促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的機(jī)制做初步探討，最終為完善OA病理機(jī)制和探尋新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。
　　研究目的：
　　觀察Lnc-RNA-UFC1對(duì)關(guān)節(jié)炎性海綿狀軟骨細(xì)胞增殖與凋亡行為的影響，并

7、從Lnc-RNA-UFC1與miR-34a相互調(diào)控的角度分析其作用途徑，為完善OA病理機(jī)制和探尋新的治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.OA軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)和樣本選取
　　以30名行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的OA患病者為病理對(duì)象取其OA軟骨細(xì)胞，20例不曾患OA或者RA（類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）預(yù)行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的股骨頸骨折患者的正常軟骨細(xì)胞做為對(duì)照組，術(shù)中留取軟骨組織。采用兩步酶消化法分離人的軟骨細(xì)胞，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取

8、2、3、4代細(xì)胞各培養(yǎng)14d，制備生長(zhǎng)曲線，并采用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)定軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的表達(dá)情況，選取生長(zhǎng)良好、Ⅱ型膠原充足的細(xì)胞納入樣本。
　　2.OA軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞的UFC1表達(dá)和行為學(xué)特征
　　納入實(shí)驗(yàn)的OA軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞，采用96孔板培養(yǎng)，37℃，5％CO2培養(yǎng)48h，采用定量實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)測(cè)定UFC1表達(dá)水平，采用CCK-8細(xì)胞增殖活力實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖活力，采用Annexin V和PI雙染流式細(xì)胞實(shí)

9、驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞凋亡率，對(duì)比各個(gè)指標(biāo)的組間差異。
　　3.UFC1過表達(dá)和沉默對(duì)行為學(xué)特征的影響
　　采用siRNA技術(shù)分別構(gòu)建UFC1過表達(dá)(UFC1 overexpression)和UFC1干擾慢病毒載體質(zhì)粒（簡(jiǎn)稱為shRNA1與shRNA2），轉(zhuǎn)染至OA軟骨細(xì)胞。96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，設(shè)立對(duì)照組（Controls1），空載質(zhì)粒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組（Controls2）、UFC1組過表達(dá)組(UFC1 over expression)及UF

10、C1沉默組（shRNA1與shRNA2）。Controls1僅含OA軟骨細(xì)胞、Controls2加入空載質(zhì)粒和脂質(zhì)體共培養(yǎng)、UFC1over expression、shRNA1及shRNA2分別加入相應(yīng)的UFC1-siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物進(jìn)行共培養(yǎng)，37℃，5％ CO2共培養(yǎng)48h，對(duì)比各組細(xì)胞細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞凋亡率，繼續(xù)培養(yǎng)，繪制14d生長(zhǎng)曲線。
　　4.OA軟骨細(xì)胞中UFC1與miR-34a的相關(guān)性考察
　　納入實(shí)驗(yàn)的

11、OA軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞，37℃，5％ CO2培養(yǎng)48 h，采用定量實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)測(cè)定miR-34a表達(dá)水平，分析miR-34a mRNA表達(dá)與UFC1mRNA表達(dá)的相關(guān)性。
　　5.OA軟骨細(xì)胞UFC1與miR-34a的相互作用
　　使用脂質(zhì)體2000將pcDNA3.1-MS2，pcDNA3.1-MS2-UFC1或者pcDNA3.1-MS2-UFC1-mut和pMS2-GFP細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，37℃，5％ CO2培養(yǎng)48h

12、后，再以EZ-Magna RIPRNA結(jié)合蛋白免疫沉淀試劑盒對(duì)細(xì)胞使用GFP抗體進(jìn)行RIP分析。并將原代或者變異全長(zhǎng)型UFC1克隆到pmirGLO質(zhì)粒受體中，以上所有原代與變異的受體攜帶體和模擬生物體內(nèi)源miR-34a均被導(dǎo)入細(xì)胞中，在37℃，5％ CO2培養(yǎng)48h后，通過雙熒光素酶受體分析系統(tǒng)測(cè)量熒光素活性。
　　6.UFC1通過miR-34a調(diào)控OA軟骨細(xì)胞的行為學(xué)特征
　　進(jìn)行靶向干預(yù)實(shí)驗(yàn)，96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，設(shè)立對(duì)照組

13、（Controls）、UFC1沉默組（shRNA1與shRNA2）、miR-34a抑制劑干預(yù)組(miR-34a inhibitor)、UFC1過表達(dá)組(UFC1 over expression)和miR-34a干預(yù)組(miR-34a); Controls正常培養(yǎng);shRNA1、shRNA2和miR-34a inhibitor均采用siRNA實(shí)驗(yàn)構(gòu)建UFC1干擾質(zhì)粒，且miR-34a inhibitor額外添加miR-34a抑制劑;UFC

14、1 over expression和miR-34a均采用siRNA實(shí)驗(yàn)構(gòu)建UFC1過表達(dá)質(zhì)粒，且miR-34a額外添加miR-34a，37℃，5％CO2培養(yǎng)48 h，測(cè)定細(xì)胞增殖活力、凋亡率及14d生長(zhǎng)曲線。
　　7.UFC1通過miR-34a調(diào)控OA軟骨細(xì)胞的行為學(xué)的機(jī)制研究
　　進(jìn)行靶向干預(yù)實(shí)驗(yàn)，96孔板培養(yǎng)細(xì)胞，設(shè)立對(duì)空白對(duì)照組（Controls1）、空載質(zhì)粒組（Controls2）、UFC1沉默組(shRNA)、mi

15、R-34a抑制劑組(miR-34ainhibitor)。Controls1僅OA軟骨細(xì)胞;Controls2同時(shí)含有OA軟骨細(xì)胞和空白脂質(zhì)體質(zhì)粒;shRNA以siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)沉默UFCI（取第一、二部分實(shí)驗(yàn)的shRNA1，重新命名為shRNA），miR-34a inhibitor在沉默UFC1的基礎(chǔ)上加入miR-34a inhibitor，37℃，5％ CO2，培養(yǎng)72 h分別以熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)和免疫蛋白印跡(WB)實(shí)驗(yàn)測(cè)定ADAM

16、TS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-9、MMP-13的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果：
　　1.OA軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)和樣本選取
　　軟骨細(xì)胞于培養(yǎng)的第3d左右開始生長(zhǎng)，7～10 d生長(zhǎng)速率達(dá)到頂峰，之后由于進(jìn)入減速期，第2、3代細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于4代。對(duì)各代細(xì)胞的Ⅱ型膠原進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)，2代細(xì)胞著色良好;3代細(xì)胞著色減弱，但仍見較清晰的陽性細(xì)胞;4代細(xì)胞著色差，已發(fā)生較大程度

17、的變異，故以第2、3代細(xì)胞作為主要樣本。
　　2.OA軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞的UFC1表達(dá)和行為學(xué)特征
　　OA患者軟骨細(xì)胞的UFC1 mRNA表達(dá)水平明顯低于正常軟骨細(xì)胞，細(xì)胞增殖活力低于正常的軟骨細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率高于正常的軟骨細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3.UFC1過表達(dá)和基因沉默對(duì)行為學(xué)特征的影響
　　UFC1過表達(dá)組OA軟骨細(xì)胞組的UFC1表達(dá)量明顯高于未轉(zhuǎn)染組（Controls1，P＜

18、0.01），同時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速率和增殖活力明顯提高，凋亡率降低，與Controls1相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;shRNA1和shRNA2OA軟骨細(xì)胞的UFC1表達(dá)量明顯低于未基因沉默者（Controls1，P＜0.01），同時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速率和增殖活力明顯降低，凋亡率升高，與Controls1相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　4.OA軟骨細(xì)胞中UFC1與miR-34a的相關(guān)性考察
　　OA患者軟骨細(xì)胞miR

19、-34a mRNA表達(dá)水平明顯高于正常軟骨細(xì)胞(P＜0.05)，進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，OA患者軟骨細(xì)胞miR-34a mRNA表達(dá)與UFC1 mRNA表達(dá)具有負(fù)相關(guān)性(R2=0.6173，P＜0.05)。
　　5.OA軟骨細(xì)胞UFC1與miR-34a的相互作用
　　RIP法下調(diào)UFC1的內(nèi)源性microRNA水平后，UFCI在軟骨組織中的RIP水平與空白組相比miR-34a水平顯著增加(MS2)，UFCI在miR-34a作用靶

20、點(diǎn)發(fā)生突變(UFCI-mut)。熒光素酶受體分析結(jié)果顯示miR-34a的過度表達(dá)減少了原代受體因子的熒光素酶活性，而不是空載體或者突變受體載體。由AGO2下調(diào)的UFC1在miR-34a過度表達(dá)的細(xì)胞中含量顯著增加，且原代UFC1過度表達(dá)而并非變異體抑制了miR-34a水平。
　　6.UFC1通過miR-34a調(diào)控OA軟骨細(xì)胞的行為學(xué)特征
　　與Controls相比，shRNA1和shRNA2OA軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)速率減慢，增殖活

21、力降低，凋亡率升高;給予miR-34a inhibitor后，OA軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)速率增快，增殖活力升高，凋亡率降低;各組間的比較明顯存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。與Controls相比，UFC1 over expression OA軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)速率增快，增殖活力升高，凋亡率降低;經(jīng)miR-34a干預(yù)后，OA軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)速率減低，增殖活力降低，凋亡率升高，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　7.UFC1通過miR-3

22、4a調(diào)控OA軟骨細(xì)胞的行為學(xué)的機(jī)制研究
　　與Control1相比，Control2的各個(gè)指標(biāo)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;shRNA的ADAMTS-4 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高，而給予miR-34a抑制劑后(miR-34a inhibitor)明顯降低，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;而同法測(cè)定shRNA的ADAMTS-5 mRNA組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;shRNA的MMP-3、MMP-9與

23、MMP-13 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯升高，而給予miR-34a抑制劑后(miR-34a inhibitor)明顯降低，均發(fā)現(xiàn)組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.本研究對(duì)OA軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞的LncRNA-UFC1表達(dá)情況進(jìn)行考察，并通過獲得性喪失研究LncRNA-UFC1對(duì)軟骨細(xì)胞的行為學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)LncRNA-UFC1能夠促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞的增殖活性，抑制其凋亡率，促進(jìn)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)，在O

24、A的病理機(jī)制中可能介導(dǎo)重要作用。
　　2.LncRNA-UFC1對(duì)OA病理的調(diào)控可能與miR-34a有關(guān)，LncRNA-UFC1與miR-34a結(jié)合后使其表達(dá)沉默，功能受到抑制，從而促進(jìn)了OA軟骨組織的細(xì)胞增殖并抑制其細(xì)胞凋亡，對(duì)該機(jī)制的深入研究，有可能會(huì)為OA的臨床上的診治提出新的靶點(diǎn)。
　　3.LncRNA-UFC1與miR-34a結(jié)合后，能抑制其下游信號(hào)分子ADAMTS-4、MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達(dá)，