單味中藥骨碎補(bǔ)對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：骨關(guān)節(jié)炎（OA），是由于多種因素引起的多發(fā)于老年人的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，60歲以上的人群中，50％人群在X線上有骨性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，其中35％-50％有臨床表現(xiàn)；75歲以上的人群中，80％有骨性關(guān)節(jié)炎癥狀。隨著人口老齡化的進(jìn)展，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率逐年上升，發(fā)病年齡也有下降趨勢(shì)，有資料報(bào)道45歲以上人群骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率超過(guò)40％。隨著我國(guó)步入老齡化人口社會(huì)，骨關(guān)節(jié)炎正日漸成為醫(yī)患共同關(guān)注的焦點(diǎn)，為此世界衛(wèi)生組織（WHO）將10月12日定為

2、“世界骨關(guān)節(jié)炎日”，21世紀(jì)頭十年為“骨關(guān)節(jié)病十年”。骨性關(guān)節(jié)炎是膝關(guān)節(jié)炎癥中最常見(jiàn)的疾病。膝骨性關(guān)節(jié)炎在老年人群中最為常見(jiàn)，尤其是在肥胖的老年人群。男女均可發(fā)病，女性多于男性。臨床觀察證實(shí)，膝骨性關(guān)節(jié)炎患者已普遍擴(kuò)展到35歲以上人群，嚴(yán)重困擾著人們的日常生活與勞動(dòng)。
　　 骨關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)學(xué)中屬于“痹病”，“骨痹”范疇，肝腎不足，筋骨失養(yǎng)是重要發(fā)病機(jī)制。骨碎補(bǔ)性味苦、溫，活血續(xù)傷，補(bǔ)腎強(qiáng)骨，為骨傷科要藥，具有一定的改善軟骨細(xì)胞功

3、能，推遲軟骨細(xì)胞退行性變的作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)主要利用細(xì)胞、分子生物學(xué)技術(shù)，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、蛋白印跡（Western-blot）等檢測(cè)方法，通過(guò)軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的不同表達(dá)，進(jìn)一步探討OA發(fā)病機(jī)制，研究骨碎補(bǔ)作用機(jī)理，觀察其對(duì)實(shí)驗(yàn)性兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)行了理論分析，為中醫(yī)藥防治膝骨性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)與臨床提供理論與實(shí)際應(yīng)用的依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：成年

4、新西蘭大耳白兔24只，普通級(jí)，雌雄不分，重量2-3kg。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。
　　 2、實(shí)驗(yàn)藥物
　　 2.1骨碎補(bǔ)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供。水煎濃縮成含生藥濃度1g/ml的藥液備用，共計(jì)630ml。
　　 2.2維固力愛(ài)爾蘭Rottapharm Ltd，批號(hào)：H20040637，規(guī)格：0.25g（以硫酸氨基葡萄糖計(jì)），遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供。
　　 3、實(shí)驗(yàn)主要試劑

5、　　 1）Western Blot檢測(cè)用Ⅰ抗抗體：鼠抗兔單克隆抗體IL-1、羊抗兔TNF-α、鼠抗兔MMP3、鼠抗兔Bcl-2、羊抗兔BAX、鼠抗兔Caspase-3、羊抗兔β-actin。Ⅱ抗抗體：堿性磷酸酶標(biāo)記兔抗鼠、兔抗羊抗體。2）內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑：3％過(guò)氧化氫溶液。3）封閉用正常小牛血清白蛋白工作液。4）堿性磷酸酶標(biāo)記的Ⅱ抗工作液。5）濃縮PBS緩沖溶液。6）3，3-氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽（DAB）。7）總RNA提取試劑異硫

6、氰酸胍。8）反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）。9）RNA酶抑制劑。10）dNTP混合液。11）Oligo（dT）15。12）γ-Taq DNA聚合酶。13）目的基因引物。14）瓊脂糖。15）考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒。16）硝酸纖維素膜。17）其他試劑：6×凝膠上樣緩沖液、DNA電泳緩沖液（TBE）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺（Acr）、3％戊二醛溶液、甲醇、顯影液、定影液、丙酮、二甲苯、無(wú)水乙醇、甲醛、脫脂奶粉等

7、購(gòu)于華美公司。
　　 4、實(shí)驗(yàn)主要儀器與設(shè)備
　　 1）OLYMPUS顯微鏡。2）電熱恒溫水箱。3）切片機(jī)。4）制冰機(jī)。5）小型臺(tái)式離心機(jī)。6） PCR擴(kuò)增儀。7）紫外分光光度計(jì)。8）電泳儀。9）半干轉(zhuǎn)印儀。10）水平搖床。11）垂直板電泳裝置。12） Chemi Imager5500凝膠電泳成像分析系統(tǒng)。13） HITACHI-7500型透射電鏡。
　　 5、兔膝OA的建立：兔左后肢伸直位管型石膏固定6周得到兔

8、膝OA的模型。
　　 6、動(dòng)物分組及給藥：新西蘭大耳白兔24只，隨機(jī)分為4組。空白組6只，不造模，不用藥，正常飼料喂養(yǎng)。模型組6只，造模后不用藥，正常飼料喂養(yǎng)。治療組（骨碎補(bǔ)組）6只，造模后灌胃，1次/天，用藥4周。對(duì)照組（維固力組）6只，造模后灌胃，1次/天，用藥4周。
　　 7、動(dòng)物處死及取材：用藥4周后，以耳緣靜脈空氣栓塞法處死各組動(dòng)物。
　　 8、電鏡觀察：在4℃條件下，置于3％戊二醛固定液中浸泡24小時(shí)

9、后，環(huán)氧丙烷透明液脫鈣，用0．1M磷酸緩沖液沖洗3次，再加0.1％四氧化鋨固定60min，去離子水沖洗3次，終止鋨酸反應(yīng)，不同濃度乙醇逐級(jí)脫水，以Epon812環(huán)氧樹(shù)脂浸透、包埋，硬化后修塊半薄切片，定位后超薄切片，切片厚60nm，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色透射電鏡觀察并攝片。
　　 9、RT-PCR檢測(cè)
　　 1）TRIzol法抽提總RNA。2）RNA濃度和純度測(cè)定。3）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。4） PCR擴(kuò)增：應(yīng)用Bi

10、ometra PCR擴(kuò)增儀。5）RT-PCR產(chǎn)物電泳及分析定量。
　　 10、Western-blot檢測(cè)
　　 1）蛋白的提取。2）蛋白濃度的測(cè)定。3）蛋白變性。4）配膠。5）電泳。6）轉(zhuǎn)印。7）封閉。8）一抗孵育。9）二抗孵育。10）清洗。11）顯色。12）Western Blot結(jié)果量化分析：采用FlourChem V2.0凝膠成像分析軟件（America）分析，記錄每條蛋白電泳帶的灰度值，進(jìn)行定量分析。
　

11、　 11、數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)：采用SPSS13.0軟件包對(duì)RT-PCR和Western Blot結(jié)果進(jìn)行方差分析和Pearson相關(guān)分析，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、大體形態(tài)觀察：空白組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，略呈淡藍(lán)色。模型組軟骨表面呈淡白色，仔細(xì)觀察可見(jiàn)有散在小的點(diǎn)狀和條形凹陷。治療組和對(duì)照組軟骨表面也呈淡白色或淡黃色，表面尚光滑，但均可見(jiàn)有散在的點(diǎn)狀凹陷。
　　 2、

12、電鏡下超微結(jié)構(gòu)的變化：電鏡下觀察軟骨表面的超微結(jié)構(gòu)空白組表面較為平整，可見(jiàn)有勻稱的細(xì)小微孔，覆蓋有點(diǎn)狀分布的白色圓球形凝膠樣物質(zhì)；模型組表面粗糙，凹凸不平，局部出現(xiàn)龜裂樣改變，嚴(yán)重者表層脫失，其下的膠原纖維裸露，或者軟骨表面出現(xiàn)裂隙，膠原纖維斷裂；治療組病變相對(duì)較輕，表面尚平整，表面覆蓋有較大的圓形凝膠樣物質(zhì)，可見(jiàn)散在鱗屑樣改變，局部有裂隙和小孔形成；對(duì)照組軟骨表面欠平整，可見(jiàn)較多的裂隙和小孔和大小不一的淺潰瘍形成，局部表層撕裂剝脫，呈

13、片狀卷起，露出其下的膠原纖維。
　　 軟骨細(xì)胞鏡下觀察顯示，空白組細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞膜完整，輪廓清晰，核內(nèi)染色質(zhì)均勻分布。細(xì)胞外可見(jiàn)縱橫交錯(cuò)的膠原纖維。模型組細(xì)胞膜溶解，核膜不清，胞質(zhì)消失，可見(jiàn)細(xì)胞腫脹，壞死明顯增多。細(xì)胞周?chē)哪z原纖維減少，排列紊亂，有的彼此聚集成團(tuán)狀或捆狀，并出現(xiàn)交錯(cuò)現(xiàn)象，有的局部稀疏。治療組核固縮，線粒體溶解，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹；對(duì)照組核濃縮，核膜不清，線粒體溶解擴(kuò)張。治療組與對(duì)照組細(xì)胞周?chē)z原纖維排列欠規(guī)則。

14、r>　　 3、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果：模型組較空白組的TNF-α mRNA、MMP3mRNA、caspase-3mRNA、BAXmRNA表達(dá)水平明顯上升，差異有顯著性；對(duì)照組較模型組的TNF-α mRNA、MMP3mRNA、caspase-3mRNA、BAXmRNA表達(dá)水平有所下降，差異有顯著性；治療組較模型組的TNF-α mRNA、MMP3mRNA、caspase-3mRNA、BAXmRNA表達(dá)水平明顯下降，差異有顯著性；治療組較對(duì)照

15、組的TNF-α mRNA、MMP3mRNA、caspase-3mRNA、BAXmRNA表達(dá)差異無(wú)顯著性。
　　 模型組較空白組的bcl-2mRNA表達(dá)水平明顯下降，差異有顯著性；對(duì)照組較模型組的bcl-2mRNA表達(dá)水平有所上升，差異有顯著性；治療組較模型組的bcl-2mRNA表達(dá)水平明顯上升，差異有顯著性；治療組較對(duì)照組的bcl-2mRNA表達(dá)差異無(wú)顯著性。
　　 4、Western blot檢測(cè)結(jié)果：模型組較空白組的

16、IL-1、TNF-α、MMP3、caspase-3、BAX蛋白表達(dá)水平明顯上升，差異有顯著性；對(duì)照組較模型組的IL-1、TNF-α、MMP3、caspase-3、BAX蛋白表達(dá)水平有所下降，差異有顯著性；治療組較模型組的IL-1、TNF-α、MMP3、caspase-3、BAX蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異有顯著性；治療組較對(duì)照組的IL-1、TNF-α、MMP3、caspase-3、BAX蛋白表達(dá)差異無(wú)顯著性。
　　 結(jié)論：

17、　　 1.IL-1、MMP3、TNF-α、caspase-3、BAX、bcl-2等因子與骨關(guān)節(jié)炎病變過(guò)程密切相關(guān)。
　　 2.本研究證實(shí)了在OA關(guān)節(jié)軟骨中存在IL-1、MMP3、TNF-α、caspase-3、BAXmRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)，bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)減弱，可能是OA發(fā)病機(jī)制的一部分。因此，應(yīng)用各種方法，抑制IL-1、MMP3、TNF-α、caspase-3、BAX的表達(dá)，增強(qiáng)bcl-2表達(dá)及其生物效應(yīng)，有可能

18、成為治療OA的有效途徑，具有重要的意義。
　　 3.通過(guò)RT-PCR、Western-blot檢測(cè)，單味中藥骨碎補(bǔ)較好的表達(dá)出對(duì)IL-1、MMP3、TNF-α、caspase-3、BAX、bcl-2等因子的調(diào)控作用，提示其應(yīng)用對(duì)防治OA有重要作用，有必要進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)臨床與基礎(chǔ)方面的研究。
　　 4.西藥維固力（硫酸氨基葡萄糖）與單味中藥骨碎補(bǔ)同樣表現(xiàn)出對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的抑制或增強(qiáng)作用，且本組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示無(wú)差異性