骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨重建中成骨細(xì)胞增殖與凋亡的機(jī)制.pdf

1、研究背景:骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病,以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病。最近研究表明軟骨下骨的病變?cè)诠顷P(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中起主要作用。軟骨下骨病變主要包括硬化、骨贅形成和骨小梁稀疏變窄,其中骨硬化和骨贅形成主要由成骨細(xì)胞完成,而骨小梁數(shù)目變少、間隙增寬主要由破骨細(xì)胞完成。OA軟骨下骨病變焦點(diǎn)是成骨細(xì)胞增殖和凋亡異常,且較正常成骨細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子和活性物質(zhì)。因此闡明成骨細(xì)胞增殖與

2、凋亡的調(diào)控機(jī)制,對(duì)闡明軟骨下骨的病變機(jī)制,對(duì)提出新的OA.治療措施有極大幫助。
　　 成人的骨轉(zhuǎn)化和骨重建過(guò)程中成骨細(xì)胞主要作用是合成骨質(zhì),在完成轉(zhuǎn)化或重建后,可分化為骨襯細(xì)胞、骨細(xì)胞或發(fā)生凋亡從體內(nèi)消失。軟骨下骨中新生成骨細(xì)胞由骨髓間充質(zhì)遷移而來(lái),與凋亡消失的細(xì)胞成一定數(shù)量比例。成骨細(xì)胞增殖和凋亡是維持成骨細(xì)胞數(shù)目的和功能穩(wěn)定關(guān)鍵環(huán)節(jié)。而成骨細(xì)胞的增殖和凋亡受基因的嚴(yán)格調(diào)控,并受體內(nèi)多種因素的調(diào)節(jié)。但目前對(duì)成骨細(xì)胞在軟骨下骨中

3、遷移、增殖、分化和凋亡過(guò)程中存在的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。
　　 OA過(guò)程中軟骨細(xì)胞發(fā)生大量凋亡已被證實(shí),細(xì)胞凋亡過(guò)程受多種凋亡基因嚴(yán)密調(diào)控。細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞凋亡因子,但受制于凋亡檢測(cè)技術(shù),過(guò)去研究每次只能針對(duì)幾個(gè)因子進(jìn)行研究,但調(diào)控網(wǎng)絡(luò)涉及眾多因子,因此到目前詳細(xì)的凋亡調(diào)控機(jī)制仍不清楚。OA中成骨細(xì)胞不斷發(fā)生凋亡,并在軟骨下骨硬化病變中起到重要作用。但由于成骨細(xì)胞處于骨組織內(nèi)對(duì)其凋亡的檢測(cè)受到極大的限制。如何高效、準(zhǔn)確

4、地檢測(cè)軟骨和軟骨下骨中的細(xì)胞凋亡是目前OA研究中亟待解決的問(wèn)題。近年,蛋白質(zhì)組學(xué)飛速發(fā)展,檢測(cè)蛋白質(zhì)的技術(shù)越來(lái)越先進(jìn)。上世紀(jì)出現(xiàn)的蛋白芯片技術(shù)在蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域中展現(xiàn)出其強(qiáng)大功能?？贵w芯片是蛋白質(zhì)芯片的一種,根據(jù)抗體抗原的特異性反應(yīng)原理,可同時(shí)檢測(cè)多種蛋白質(zhì),且操作簡(jiǎn)便,具有極高的靈敏性。目前已出現(xiàn)多種可直接完成對(duì)血液、尿液、細(xì)胞裂解液中細(xì)胞因子檢測(cè)的抗體芯片。當(dāng)今先進(jìn)的芯片技術(shù)為疾病相關(guān)分子的發(fā)現(xiàn)、疾病的分子診斷和治療藥物的開(kāi)發(fā)提供高效

5、快捷的研究手段。目前還沒(méi)有出現(xiàn)針對(duì)OA研究的芯片,如何采用目前的抗體芯片技術(shù)來(lái)認(rèn)識(shí)和解決OA中細(xì)胞凋亡問(wèn)題,值得我們積極探索。
　　 前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)在體內(nèi)外具有強(qiáng)大的骨代謝調(diào)節(jié)作用。PGE2可通過(guò)細(xì)胞表面的4種特異性受體作用于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞,產(chǎn)生顯著的骨形成和骨吸收效果。OA患者的軟骨下骨中成骨細(xì)胞分泌PGE2量存在差異,可分為高低兩類(lèi),代表了兩種不同類(lèi)型OA。在高OA病人,其成骨

6、細(xì)胞分泌大量PGE2,軟骨下骨較低OA組和正常軟骨下骨硬化程度高,提示OA軟骨下骨中PGE2的含量與成骨細(xì)胞的功能狀態(tài),增殖和凋亡的調(diào)控都有密切關(guān)系。但PGE2對(duì)成骨細(xì)胞增殖和凋亡的具體調(diào)控機(jī)制仍不清楚。p21又稱(chēng)p21WAF1/CIP1是細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制因子,與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡具有密切關(guān)系。p21在成骨細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控中具有重要作用,但PGE2對(duì)成骨細(xì)胞的p21作用如何目前未有報(bào)道。HSP27是熱休克蛋白sHSP亞家

7、族中的重要一員,保護(hù)細(xì)胞免受各種應(yīng)激因素的損傷,并參與細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié),誘導(dǎo)型HSP27主要在細(xì)胞受到高溫、紫外線(xiàn)、藥物等刺激下大量表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號(hào)通路。
　　 目的:采用可同時(shí)檢測(cè)43種凋亡相關(guān)蛋白的人類(lèi)細(xì)胞凋亡因子抗體芯片對(duì)人OA關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨組織進(jìn)行分析。探討OA軟骨和軟骨下骨中細(xì)胞凋亡因子的變化,以進(jìn)一步了解細(xì)胞凋亡與OA發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。研究PGE2對(duì)成骨細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控作用

8、與p21的關(guān)系,為闡明OA軟骨下骨病變提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法
　　 1.采用RayBio(R)公司研發(fā)的人類(lèi)細(xì)胞凋亡因子抗體芯片檢測(cè)技術(shù)。關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨組織取自全關(guān)節(jié)置換OA病人的膝關(guān)節(jié),正常對(duì)照關(guān)節(jié)取自外傷截肢患者。液氮研磨提取關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨總蛋白,芯片檢測(cè)嚴(yán)格按操作說(shuō)明進(jìn)行,室溫下封閉30min,加樣品蛋白稀釋液置4°恒溫?fù)u床孵育過(guò)夜,次日加一抗室溫孵育2h,漂洗3次,加HRP-二抗室溫孵育1.5h,漂洗

9、3次,化學(xué)發(fā)光法檢測(cè),激光掃描儀掃描x膠片,圖像由RayBio(R)圖像軟件分析,數(shù)據(jù)組間比較采用獨(dú)立樣本f檢驗(yàn),P值<0.05,為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.10umol/L PGE2處理MC3T3-E1成骨細(xì)胞30min,2h,4h。對(duì)照組不處理。提取各組細(xì)胞RNA,通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞p21、HSP27 mRNA的變化。提取各組細(xì)胞總蛋白,western blot檢測(cè)p21、HSP27蛋白表達(dá)的變化

10、。
　　 結(jié)果
　　 1.采用人凋亡因子抗體芯片對(duì)OA軟骨和軟骨下骨進(jìn)行分析并與正常關(guān)節(jié)的做比較發(fā)現(xiàn),正常軟骨和OA軟骨的芯片膜檢測(cè)位點(diǎn)全部表達(dá),陽(yáng)性對(duì)照位點(diǎn)明顯,陰性對(duì)照位點(diǎn)未有信號(hào)。OA軟骨中共有38種凋亡因子較正常組表達(dá)顯著增高(P值均<0.05),包括bad、bax、bcl-2、p53、caspase-3等。OA軟骨中BID表達(dá)顯著下調(diào)(P=0.002)。CD40、FasL等4種因子表達(dá)變化不顯著(P值均>0.0

11、5)。軟骨下骨的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)所有芯片上的位點(diǎn)都有顯影,OA組與正常組比較只有9種凋亡因子顯著變化(P值均<0.05),其余因子變化不顯著(P值均>005)。
　　 2.采用10umol/L,PGE2處理MC3T3-E1成骨細(xì)胞30min,2h,4h后。采用Real-time PCR法檢測(cè)p21和HSP27 mRNA,western blot檢測(cè)p21和HSP27蛋白發(fā)現(xiàn),p21 mRNA和蛋白量隨時(shí)間增加表達(dá)增高,在2h時(shí)達(dá)高峰。H