三疣梭子蟹甲基法尼酯合成及在卵巢發(fā)育和蛻皮中的作用.pdf

1、萜類激素甲基法尼酯（MF）是昆蟲保幼激素III（JH III）的非環(huán)氧化形式，其參與調(diào)控甲殼動(dòng)物的生長、蛻皮、生殖及滲透壓調(diào)節(jié)等多種生理過程，被一致認(rèn)為是甲殼動(dòng)物中JH的對等物。MF的生理功能及作用機(jī)理一直是甲殼動(dòng)物內(nèi)分泌研究的熱點(diǎn)，但其在甲殼動(dòng)物卵巢發(fā)育及蛻皮中的作用卻存在爭議，很有可能因物種的不同而有所區(qū)別。由此，本研究對三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）MF合成過程中相關(guān)酶的基因進(jìn)行分子克隆和表達(dá)分析，

2、并結(jié)合MF血淋巴含量水平，對 MF在卵巢發(fā)育和蛻皮中的作用進(jìn)行了探討，為利用內(nèi)分泌調(diào)控手段解決三疣梭子蟹人工增養(yǎng)殖過程中遇到的“性早熟”及“蛻皮未遂”等現(xiàn)象提供理論依據(jù)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴通過轉(zhuǎn)錄組測序篩選得到了54個(gè)與三疣梭子蟹內(nèi)分泌調(diào)控相關(guān)的基因，這其中也包括一些 MF合成相關(guān)酶的基因。利用這些基因的序列信息，我們對三疣梭子蟹的乙酰輔酶 A酰基轉(zhuǎn)移酶（AACT）、法尼焦磷酸合成酶（FPS）和保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶（JH

3、AMT）等3個(gè)MF合成酶的全長cDNA進(jìn)行了克隆和生物信息學(xué)分析。進(jìn)一步的組織表達(dá)分析顯示 PtAACT、PtFPS和PtJHAMT均在大顎器（MO）中表達(dá)水平最高，這與 MO是甲殼動(dòng)物 MF主要合成器官的觀點(diǎn)相符。⑵利用dsRNA介導(dǎo)的RNA干擾（RNAi）技術(shù)對 PtJHAMT在三疣梭子蟹 MF合成中的作用進(jìn)行了研究。注射 PtJHAMT和 PtFAMeT的dsRNA均能降低三疣梭子蟹血淋巴中 MF的含量，但 PtJHAMT的表達(dá)受

4、 MF合成早期限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶 A還原酶（HMGR）基因沉默的影響，而 PtFAMeT卻不受影響，說明PtJHAMT不僅參與三疣梭子蟹 MF的生物合成，且其催化特異性可能要強(qiáng)于PtFAMeT。⑶分析了眼柄切除（ESA）對三疣梭子蟹血淋巴 MF含量及其合成相關(guān)酶基因表達(dá)的影響。ESA處理后，三疣梭子蟹血淋巴 MF濃度水平和 MO中 PtHMGR、PtFPS、PtFAMeT和 PtJHAMT表達(dá)水平的均顯著上升，表明眼柄神

5、經(jīng)肽類激素可能通過調(diào)控 MF合成相關(guān)酶基因的表達(dá)來抑制 MO中 MF的生物合成。由于PtAACT的表達(dá)并未受到 ESA的影響，說明 MO中的乙?；x可能不受眼柄神經(jīng)肽類激素的調(diào)控。⑷在分析PtAACT、PtFPS和PtJHAMT在三疣梭子蟹卵巢發(fā)育過程中的表達(dá)水平變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同 MF合成酶基因的表達(dá)水平均在第二次卵巢發(fā)育 III期顯著上升，與血淋巴 MF含量變化趨勢一致；但它們在第一次卵巢發(fā)育過程中則有著不同的表達(dá)模式：PtJHAM

6、T的表達(dá)水平在第一次卵巢發(fā)育 III期顯著上升，與血淋巴MF含量變化一致，再次說明 PtJHAMT參與催化 MF的合成。PtAACT和 PtFPS的表達(dá)水平分別在第一次卵巢發(fā)育I期和IV期顯著上升，PtAACT可能參與三疣梭子蟹卵巢未發(fā)育時(shí)期 MO中的物質(zhì)合成與代謝，而 PtFPS則可能還參與MO中其他類異戊二烯化合物的合成。我們進(jìn)一步利用離體組織培養(yǎng)及活體注射等實(shí)驗(yàn)手段研究了 MF對三疣梭子蟹卵巢發(fā)育的影響。兩個(gè)實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn) MF能顯著

7、刺激三疣梭子蟹肝胰腺中 Vg的表達(dá)，但對卵巢中 Vg的表達(dá)水平無明顯影響，說明 MF主要是通過促進(jìn)肝胰腺中Vg的合成來加速卵巢發(fā)育。⑸研究了鹽度脅迫對三疣梭子蟹血淋巴 MF含量及其合成相關(guān)酶基因表達(dá)的影響。低鹽海水能夠快速提升三疣梭子蟹血淋巴 MF的濃度水平，但高鹽海水則對血淋巴MF含量并無影響。與之相應(yīng)，低鹽海水能顯著提升 PtFPS、PtFAMeT和 PtJHAMT的基因表達(dá)水平，但高鹽海水則對MF合成相關(guān)酶的基因表達(dá)并無影響。這說