右歸丸調(diào)控FNDC5缺失小鼠骨-脂代謝的初步研究.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建FNDC5缺失模型，明確FNDC5缺失對(duì)骨-脂代謝的影響，探討補(bǔ)腎方劑右歸丸上調(diào)FNDC5改善骨-脂代謝的作用和機(jī)制。
　　方法:
　　1、采用Talen技術(shù)構(gòu)建FNDC5基因缺失模型，通過提取DNA、PCR擴(kuò)增、基因測(cè)序等方法，確定模型的構(gòu)建是否成功，并通過熒光定量PCR檢測(cè)肌肉中FNDC5的表達(dá);
　　2、將構(gòu)建成功的小鼠模型進(jìn)行分組，分為野生組、FNDC5缺失組、右歸丸+FNDC5缺失組，每

2、組8只，雌雄各半。右歸丸組按16.65g/kg每日灌胃，灌胃4周，野生組、FNDC5缺失組每日灌胃生理鹽水。4周后2％水合氯醛麻醉后取材;
　　3、各組小鼠血清進(jìn)行Irisin的ELISA檢測(cè);
　　4、右歸丸對(duì)FNDC5缺失小鼠脂代謝的作用:對(duì)各組小鼠稱重，檢測(cè)血中甘油三酯(TG)含量，提取皮下脂肪RNA，RT-qPCR檢測(cè)FNDC5、PGC-1α、UCP1 mRNA的表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)脂肪UCP1蛋白的表達(dá);
　　

3、5、右歸丸對(duì)FNDC5缺失小鼠骨代謝的作用:血清堿性磷酸酶(ALP)活力分析;micro-CT檢測(cè)各組小鼠骨密度和骨微細(xì)結(jié)構(gòu)，HE染色觀察各組小鼠形態(tài)學(xué)變化，提取股骨RNA，Real-time PCR檢測(cè)FNDC5、Runx2 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建FNDC5缺失模型，肌肉中FNDC5 mRNA表達(dá)量明顯降低（P＜0.01)。
　　2、各組小鼠血清進(jìn)行Irisin的ELISA檢測(cè)結(jié)果:與野生組比

4、較，F(xiàn)NDC5基因缺失小鼠的血中Irisin蛋白含量明顯降低（P＜0.01);與FNDC5缺失組比較，右歸丸組血中Irisin蛋白含量顯著升高(P＜0.01)。
　　3、右歸丸對(duì)FNDC5缺失小鼠脂代謝的作用:
　　(1)與野生組比較，F(xiàn)NDC5缺失組在各時(shí)間點(diǎn)的體重?zé)o明顯差異。右歸丸組從第4周開始干預(yù)，與FNDC5缺失組比較，雌性小鼠中，右歸丸組從藥物干預(yù)開始體重明顯降低，在第5周，體重雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異但有下降趨勢(shì);第6、7

5、、8周，體重較FNDC5缺失組顯著降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）;雄性小鼠中，右歸丸組從藥物干預(yù)開始體重較FNDC5缺失組雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但有降低的趨勢(shì);
　　(2)與野生組比較，雌、雄小鼠FNDC5缺失組血清中TG含量明顯升高（P＜0.01）;與FNDC5缺失組比較，右歸丸組血清中TG含量顯著降低（P＜0.01）;
　　(3)與野生組比較，F(xiàn)NDC5缺失組雌、雄小鼠皮下脂肪中FNDC5mRNA的表達(dá)均明顯降低（P＜

6、0.05)，PGC-1α和UCP1 mRNA的表達(dá)均顯著升高（P＜0.05和P＜0.01）;與FNDC5缺失組比較，右歸丸組雌、雄小鼠FNDC5的表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。在雌性小鼠中，右歸丸組UCP1的表達(dá)明顯高于FNDC5缺失組(P＜0.01);在雄性小鼠中，右歸丸組UCP1的表達(dá)同樣顯著高于FNDC5缺失組(P＜0.05)。而右歸丸組雌、雄小鼠PGC-1α的表達(dá)與FNDC5缺失組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;
　　(4)在免疫熒光

7、中，野生組UCP1表達(dá)熒光較弱，且脂肪細(xì)胞數(shù)量較少，脂滴較大;與野生組比較，F(xiàn)NDC5缺失組UCP1熒光表達(dá)明顯增強(qiáng)，且脂肪細(xì)胞數(shù)明顯增多，脂滴較小;與FNDC5缺失組比較，右歸丸組UCP1表達(dá)增多，脂肪細(xì)胞密集，脂滴較小。
　　4、右歸丸對(duì)FNDC5缺失小鼠骨代謝的作用:
　　(1)與野生組比較，雌、雄小鼠FNDC5缺失組血中ALP活力明顯降低（P＜0.01）;與FNDC5缺失組比較，右歸丸組血清中ALP活力明顯升高;

8、r>　　(2)在雌性小鼠中，與野生組比較，F(xiàn)NDC5缺失組tBMD、TbBMD、Tb.Th均明顯降低(P＜0.01)，Tb.Sp明顯升高(P＜0.01)。與FNDC5缺失組比較，右歸丸組tBMD、TbBMD、Tb.Th均明顯升高(P＜0.05、P＜0.01和P＜0.05)，Tb.Sp明顯降低(P＜0.01);在雄性小鼠中，與野生組比較，F(xiàn)NDC5缺失組tBMD，Tb.Sp未見明顯差異，TbBMD、Tb.Th雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但有下降的趨勢(shì)

9、;與FNDC5缺失組比較，右歸丸組Tb.Sp無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;tBMD，TbBMD、Tb.Th雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但有上升趨勢(shì)。
　　(3)HE染色結(jié)果可知，野生組可見骨小梁結(jié)構(gòu)完整、致密，骨小梁周圍骨細(xì)胞分布均勻;在雌性小鼠中，與野生組比較，F(xiàn)NDC5缺失組可見骨小梁數(shù)量明顯減少、稀疏，骨小梁斷裂，排列紊亂、不連續(xù)，骨小梁間距明顯增寬，形成空洞;骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少;與FNDC5缺失組比較，雌性小鼠右歸丸組骨小梁排列明顯整齊，結(jié)構(gòu)完整，骨

10、細(xì)胞明顯增多，但與野生組比較仍可見骨小梁裂痕。在雄性小鼠中，與野生組比較，F(xiàn)NDC5缺失組偶見骨小梁斷裂，排列較稀疏，骨小梁周圍骨細(xì)胞減少;與FNDC5缺失組比較，右歸丸組骨小梁排列緊密，結(jié)構(gòu)完整，骨細(xì)胞數(shù)量增加。
　　(4)在雌性小鼠中，與野生組比較，F(xiàn)NDC5缺失組FNDC5與Runx2 mRNA的表達(dá)明顯降低（P＜0.01）;與FNDC5缺失組比較，右歸丸組FNDC5與Runx2 mRNA的表達(dá)明顯升高（P＜0.05和P＜0