右歸丸干預(yù)腎間質(zhì)纖維化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　在體實(shí)驗(yàn)觀察右歸丸對(duì)腺嘌呤致大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用，離體實(shí)驗(yàn)觀察右歸丸對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用，共同探討右歸丸干預(yù)腎間質(zhì)纖維化的作用及機(jī)制研究。
　　方法:
　　1.100只SD大鼠隨機(jī)分為15d和30d兩大組，每大組50只，每大組又為空白對(duì)照組、模型組、右歸丸低(2.25 g·kg-1)、中(4.50 g·kg-1)、高(9.00 g·kg-1)劑量組5個(gè)組，每組10只。每天早晨8:0

2、0除空白對(duì)照組灌胃給予生理鹽水(NS)外，其余組均灌胃給予腺嘌呤150 mg·kg-1;每天17:00除空白對(duì)照組和模型組灌胃給予NS外，其余組均灌胃給予相應(yīng)劑量濃度的右歸丸。給藥體積均為10mL·kg-1，兩組分別連續(xù)給藥15d和30d，給藥期間定期測(cè)定各組大鼠體重。待給藥結(jié)束，行腹主動(dòng)脈取血，分離血清并檢測(cè)血清中肌酐(Cr)、尿素氮(BUN);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD);腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-1β(IL

3、-1β)、白介素-6（IL-6）。取腎稱重，左腎保存于4％多聚甲醛進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)（HE染色），膠原染色(Masson染色)，免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）測(cè)定平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達(dá)。右腎保存于-80℃冰箱備測(cè)。蛋白免疫印跡法(Westernblotting，WB)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)(Quantitative Real-time PCR，Real-t

4、ime PCR)分別檢測(cè)腎臟組織中纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)、平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ，Col-Ⅰ)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、β-鏈蛋白（β-catenin）、Wnt4的蛋白和mRNA表達(dá)。
　　2.MTT法檢測(cè)不同濃度TGF-β1(0、1.25、2.5、5.0、10、20、40、80 ng·mL-1)作用于HK-2細(xì)胞24h后細(xì)

5、胞的增殖情況;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)制備右歸丸含藥血清，MTT法檢測(cè)不同體積分?jǐn)?shù)含藥血清作用于10ng·mL-1的TGF-β1作用的HK-2細(xì)胞24h對(duì)細(xì)胞的抑制作用，顯微鏡觀察腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，WB法和Real-time PCR法分別檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞中FN、α-SMA、E-cadherin、Col-Ⅰ、TGF-β1、β-catenin、Wnt4的蛋白和mRNA表達(dá)，免疫熒光法(Immunofluorescence，IF)檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞

6、中α-SMA、β-catenin和E-cadherin的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠連續(xù)灌胃Adenine15d和30d后，與空白對(duì)照組相比較:模型組大鼠體重增長(zhǎng)幅度放緩，甚至降低，腎重和腎指數(shù)顯著增加(P＜0.01，P＜0.001)，血清中Cr、BUN顯著升高(P＜0.01)，其中30d組血清Cr、BUN升高更為顯著(P＜0.001);血清MDA顯著增加(P＜0.05，P＜0.01)，SOD顯著降低(P＜0.01，

7、P＜0.001);血清TNF-α、IL-1β、IL-6顯著增加(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)。灌胃給予不同濃度的右歸丸后，與模型組相比較:各組大鼠體重均有所增加，但沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，腎重和腎指數(shù)顯著降低，其中以中、高劑量組作用較為顯著(P＜0.05，P＜0.01)，血清中Cr、BUN顯著降低，其中15d組以中、高劑量組作用顯著(P＜0.05)，30d組右歸丸三個(gè)劑量組均具有顯著差異(P＜0.001);血清MD

8、A顯著降低，以中、高劑量組作用明顯(P＜0.05)，血清SOD顯著增加，以中、高劑量組作用明顯，顯示顯著抗氧化作用(P＜0.05);血清中TNF-α、IL-1β、IL-6顯著降低，其中以中、高劑量組作用顯著(P＜0.05，P＜0.01)，顯示顯著抗炎作用。連續(xù)灌胃Adenine15d和30d后，肉眼觀察大鼠腎臟，與空白對(duì)照組大鼠相比較，Adenine組大鼠腎臟外形和顏色均明顯改變，腎臟與腎包膜易剝離，體積明顯增大，俗稱“大白腎”，以30

9、d組改變尤為顯著;病理結(jié)果顯示，Adenine組大鼠腎小球形態(tài)破損，腎小管上皮出現(xiàn)嚴(yán)重壞死，有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔內(nèi)有結(jié)晶沉積;Masson染色結(jié)果顯示，Adenine組大鼠腎臟出現(xiàn)嚴(yán)重纖維化，腎小球嚴(yán)重壞死，30d組較15d組更為嚴(yán)重;IHC結(jié)果顯示，Adenine組大鼠腎臟中E-cadherin表達(dá)顯著減少，裂隙變大，同時(shí)有極少量棕黃色顆粒物質(zhì)表達(dá);腎臟中α-SMA表達(dá)顯著增加，與E-cadherin表達(dá)相反，裂隙顯著增大，同時(shí)有大

10、量棕黃色顆粒物質(zhì)表達(dá)。Adenine組大鼠腎臟組織中FN、Col-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1、β-catenin、Wnt4等蛋白和mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.01，P＜0.001)，E-cadherin蛋白和mRNA表達(dá)顯著減少(P＜0.001，P＜0.01)，Adenine30d組的增減變化與Adenine15 d組相比較更為顯著。灌胃給予不同濃度的右歸丸后，與Adenine組大鼠相比較，右歸丸組大鼠腎臟外形和顏色有顯著改善，體積

11、顯著減小;病理結(jié)果顯示，右歸丸組大鼠腎小球形態(tài)改善，腎小管上皮壞死減少，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)晶減少;右歸丸不同劑量組均能不同程度改善大鼠病理狀況，其中以高劑量作用顯著。Masson染色結(jié)果顯示，右歸丸組大鼠腎臟纖維化明顯改善，腎小球壞死減輕;腎臟中E-cadherin表達(dá)顯著增加，裂隙減小，出現(xiàn)大量棕黃色顆粒物質(zhì);腎臟中α-SMA表達(dá)顯著減少，裂隙減小，棕黃色顆粒物質(zhì)表達(dá)顯著減少;右歸丸組大鼠腎臟組織中FN、Col-Ⅰ、α-SMA、TGF

12、-β1、β-catenin、Wnt4等蛋白和mRNA表達(dá)顯著減少(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)，E-cadherin蛋白和mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.01，P＜0.05)，且改變均呈劑量依賴性，右歸丸30d組的增減變化較15d組更為顯著。
　　2.MTT結(jié)果顯示，10 ng·mL-1的TGF-β1能夠顯著促進(jìn)HK-2細(xì)胞增殖(P＜0.05)，誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial-mesenchym

13、al transition，EMT)，不同體積分?jǐn)?shù)右歸丸含藥血清能夠抑制HK-2細(xì)胞增殖，在體積分?jǐn)?shù)10％時(shí)對(duì)HK-2細(xì)胞的抑制具顯著差異(P＜0.05)，且呈現(xiàn)劑量依賴性;在倒置顯微鏡下觀察10 ng·mL-1的TGF-β1作用HK-2細(xì)胞24h后，與空白對(duì)照組相比較:TGF-β1組細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)明顯皺縮，細(xì)胞大量增殖;HK-2細(xì)胞中FN、Col-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1、β-catenin、Wnt4等蛋白和mRNA表達(dá)顯著增加(P

14、＜0.01，P＜0.001)，E-cadherin蛋白和mRNA表達(dá)顯著減少(P＜0.001，P＜0.01);IF檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，β-catenin、α-SMA蛋白表達(dá)大量增加，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著減少。給予不同體積分?jǐn)?shù)的右歸丸含藥血清后，HK-2細(xì)胞皺縮明顯改善，且增殖被抑制;HK-2細(xì)胞中FN、Col-Ⅰ、α-SMA、TGF-β1、β-catenin、Wnt4等蛋白和mRNA表達(dá)顯著減少(P＜0.001)，E-cadherin

15、蛋白和mRNA表達(dá)顯著增加(P＜0.001);IF檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，儀-SMA和β-catenin蛋白表達(dá)顯著減少，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著增加，且均呈劑量依賴性。
　　結(jié)論:
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，右歸丸以時(shí)間依賴性方式，通過(guò)抗炎、抗氧化等改善大鼠腎功能干預(yù)腺嘌呤誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程，這可能與其調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，右歸丸通過(guò)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化，