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文檔簡介
1、目的:
以高滲誘導(dǎo)下的人角膜上皮細胞(HCECs)為研究對象,模擬干眼癥患者的眼表微環(huán)境,研究自噬是否通過調(diào)控NLRP3炎癥小體的激活來介導(dǎo)干眼炎癥反應(yīng)。
方法:
將永生化的人角膜上皮細胞(12-SV40細胞系)分別置于500 mOsm滲透壓培養(yǎng)基2h、4h、6h、8h、10h、12h模擬眼表炎癥下的上皮細胞,設(shè)正常滲透壓培養(yǎng)基組(對照組,培養(yǎng)基滲透壓為310 mOsm)。用real-time PCR檢測H
2、CECs中炎癥小體各組分NLRP3、ASC、caspase-1的mRNA的相對表達量的變化趨勢反映,Western-blot檢測LC3-II的蛋白水平表達變化趨勢反映細胞自噬的水平,并選擇出最合適的高滲透壓刺激時間為細胞模型進行后續(xù)實驗。在細胞培養(yǎng)基預(yù)先加入自噬抑制劑3-MA使3-ma濃度分別達到0、2.5、5、7.5、10mmol/L,將HCECs置于含自噬抑制劑3-MA的細胞培養(yǎng)基預(yù)處理3h后,予500mOsm高滲透壓(HOP)刺激
3、,同時設(shè)310 mOsm正常滲透壓(NOP)組驗證高滲誘導(dǎo)炎癥模型建議模型是否成功,用Western-blot檢測LC3-II的蛋白表達水平變化反映自噬水平的變化。用real-time PCR檢測HCECs炎癥小體各組分NLRP3、asc、caspase-1;炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8的mRNA基因表達水平,用免疫熒光方法觀察LC3的熒光聚集變化情況。根據(jù)ATG-5基因序列設(shè)計合成靶向人ATG-5的干擾RNA,同時設(shè)正常滲透
4、壓對照組(NOP)、高滲透壓對照組(HOP)、陰性轉(zhuǎn)染加高滲透壓對照組(HOP+siNC)和轉(zhuǎn)染加高滲透壓(HOP+siATG-5)組。用同樣的方法檢測上述炎癥因子、炎癥小體組分、細胞自噬相關(guān)基因及細胞凋亡的表達變化。
結(jié)果:
1.建立人角膜上皮細胞炎癥模型
根據(jù)Real-time PCR檢測結(jié)果顯示:與正常滲透壓組相比較,2h高滲透壓刺激組的NLRP3的mRNA相對表達量升高不明顯,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>
5、0.05),而4h高滲透壓刺激組、6h高滲透壓刺激組、8h高滲透壓刺激組、10h高滲透壓刺激組、12h高滲透壓刺激組的NLRP3的mRNA相對表達量均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時,Western-blot檢測結(jié)果顯示:與正常滲透壓組相比較,2h高滲透壓刺激組、4h高滲透壓刺激組的LC3的蛋白表達水平升高(P<0.05),而6h高滲透壓刺激組、8h高滲透壓刺激組、10h高滲透壓刺激組、12h高滲透壓刺激組的LC3的蛋白表達
6、水平明顯升高(P<0.01)。將各組結(jié)果進行比較,發(fā)現(xiàn)6h高滲透壓刺激組Real-time PCR和Western-blot檢測結(jié)果與2h高滲透壓刺激組、4h高滲透壓刺激組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),與8h高滲透壓刺激組、10h高滲透壓刺激組、12h高滲透壓刺激組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。因此,我們選擇6h高滲透壓刺激作為該細胞干眼模型的條件。
2.改變?nèi)私悄ど掀ぜ毎允伤胶髮Ω邼B環(huán)境下人角膜上皮細胞炎癥小體各
7、組分表達、炎癥因子表達、自噬相關(guān)基因及凋亡的表達情況
在自噬抑制劑3-MA對HCECs預(yù)處理3h后,予500mOsm高滲透壓(HOP)刺激6h。Western-blot檢測結(jié)果顯示,與單純高滲透壓組相比較,不同抑制劑濃度梯度下(2.5、5、7.5、10mmol/L),LC3-II的表達均下降(P<0.05),p62的表達當3-MA抑制劑濃度≥7.5 mmol/L時均升高(P<0.05),ATG-5的表達改變無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0
8、.05),當3-MA抑制劑濃度≥7.5 mmol/L時,NLRP3表達明顯升高(P<0.05),因此我們設(shè)定3-MA濃度為10 mmol/L作為后續(xù)實驗的條件。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示,與單純高滲透壓組相比較,3-MA+高滲透壓的IL-1、βIL-6及IL-8mRNA相對表達量升高(P<0.05);與單純高滲透壓組相比較,3-MA+高滲透壓的ASC、NLRP3及caspase-1的mRNA相對表達量升高(P<0.05)。<
9、br> 在成功轉(zhuǎn)染siATG-5后,予500mOsm高滲透壓(HOP)刺激6h。Western-blot檢測結(jié)果顯示,與普通滲透壓組、單純高滲透壓組及siNC+高滲透壓組相比較, siATG-5+高滲刺激組ATG-5蛋白表達量明顯下降(P<0.01);與,普通滲透壓組相比,p62的表達在siATG-5+高滲刺激組明顯上升(P<0.05);siATG-5+高滲刺激組與普通滲透壓組相比LC3-II的表達改變無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05),與
10、siNC+高滲透壓組相比LC3-II的表達明顯降低;與其他各組相比,siATG-5+高滲刺激組的NLRP3蛋白表達量明顯上升。Real-time PCR檢測結(jié)果顯示,與普通滲透壓組、單純高滲透壓組及siNC+高滲透壓組, siATG-5+高滲刺激組的IL-1β、IL-6、IL-8、NLRP3、caspase-1及ASC的mRNA相對表達量均升高(P<0.05)。
結(jié)論:
1.高滲刺激下的HCECs,細胞的自噬水平明顯
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