NLRP3炎癥小體在漢灘病毒感染THP-1細(xì)胞中的作用.pdf

1、漢灘病毒(hantaan virus,HTNV)是引起我國腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)最主要的病原體。HFRS主要表現(xiàn)為發(fā)熱、出血、低血壓休克、腎臟衰竭和多臟器功能不全綜合征,自1955年首例發(fā)病報(bào)告以來,發(fā)病率和病死率居高不下,一直是嚴(yán)重威脅我國人民生命健康的嚴(yán)重公共安全問題。HFRS的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,目前認(rèn)為病毒對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的直接損傷以及機(jī)體的免疫病理損害

2、均參與了HTNV的致病過程,尤其是機(jī)體免疫系統(tǒng)中免疫復(fù)合物的形成、炎性因子的大量分泌(炎癥風(fēng)暴)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷作用在HFRS的發(fā)病機(jī)制中扮演了極其重要的角色。
　　炎癥小體(inflammasomes)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類位于細(xì)胞內(nèi)、可以引起炎癥細(xì)胞因子IL-1β/IL-18分泌、繼而誘發(fā)炎癥反應(yīng)的多聚蛋白復(fù)合體。炎癥小體識(shí)別的配體種類非常廣泛,涵蓋了細(xì)菌、病毒、脂肪酸、結(jié)晶結(jié)構(gòu)等,是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)中重要的成份,也是機(jī)體細(xì)

3、胞抵抗外源病原體感染和消除內(nèi)源危險(xiǎn)因子刺激的首要免疫屏障。目前研究已知,多種病毒感染靶細(xì)胞后均可以激活炎癥小體,誘發(fā)局部的炎癥反應(yīng)以及后續(xù)的免疫反應(yīng)。與此同時(shí),病毒也使用了多種策略來逃逸炎癥小體的識(shí)別,從而使自身能夠在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖。
　　由于HTNV能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌IL-1β,因此,HTNV很有可能也激活了細(xì)胞內(nèi)的炎癥小體。因此,我們檢測(cè)了HTNV感染THP-1細(xì)胞后IL-1β的分泌,以及NLRP3炎癥小體相關(guān)基因

4、和蛋白水平的變化,同時(shí)評(píng)價(jià)了Ca2+在HTNV感染過程中的作用。結(jié)果如下:
　　1.我們首先構(gòu)建了HTNV-cRNA標(biāo)準(zhǔn)品,建立了熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)HTNV拷貝數(shù)的方法,所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)理想,具有良好的線性關(guān)系。通過分析擴(kuò)增曲線和融解曲線,發(fā)現(xiàn)該方法具有良好的敏感性、特異性以及重復(fù)性,用其檢測(cè)THP-1細(xì)胞培養(yǎng)上清中HTNV的病毒載量,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　2.HTNV感染THP-1細(xì)胞后,可以引起pro-IL

5、-1β蛋白表達(dá)的增加以及IL-1β的分泌,并且pro-IL-1β蛋白表達(dá)的水平和IL-1β的分泌量與感染的病毒量呈正比。同時(shí),IL-1β的分泌需要病毒復(fù)制和增殖過程的誘導(dǎo),單純的病毒核酸及蛋白刺激均不能引起IL-1β分泌。
　　3.HTNV感染THP-1細(xì)胞后,可以引起炎癥相關(guān)基因的表達(dá)增高,特別是NLRP3炎癥小體基因的表達(dá)增高,并且NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)也增高,我們還用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)了NLRP3炎癥小體在HTN

6、V感染THP-1細(xì)胞后的定位情況,分別從基因和蛋白水平證實(shí)了HTNV感染可以引起NLRP3炎癥小體的激活。此外,我們使用NLRP3 siRNA和caspase-1抑制劑,進(jìn)一步驗(yàn)證了NLRP3炎癥小體在HTNV感染中的作用。
　　4.我們還檢測(cè)了活細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+在THP-1細(xì)胞中的變化情況,發(fā)現(xiàn)HTNV感染THP-1細(xì)胞會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高,螯合細(xì)胞外Ca2+會(huì)導(dǎo)致IL-1β分泌的減少,提示Ca2+有可能參與了NLRP