嶺南溫病濕熱證小鼠模型的建立及腸道相關(guān)濕熱證實(shí)質(zhì)的研究.pdf

1、目的:
　　濕熱證是嶺南地區(qū)常見(jiàn)的體質(zhì)類型和疾病發(fā)病類型，嶺南地區(qū)沿海濕氣大，山川丘陵眾多使?jié)裥安簧⒁着c熱邪相合而攻于人體。薛生白《濕熱病篇》指出“太陰內(nèi)傷，濕飲停聚，客邪再至，內(nèi)外相引，故病濕熱”，濕熱證的發(fā)病機(jī)制存在著脾胃內(nèi)傷的誘因，故嶺南地區(qū)高蛋白的飲食習(xí)慣可能與脾胃內(nèi)傷有特殊的相關(guān)性。本研究擬通過(guò)建立具有嶺南特色的溫病濕熱證小鼠模型為研究溫病濕熱證的基礎(chǔ)，探索溫病濕熱證的腸道菌群組成變化規(guī)律、體內(nèi)炎癥反應(yīng)狀態(tài)和水通道蛋白的

2、改變情況，選擇清熱利濕代表方茵陳蘺湯進(jìn)行反證，并探索茵陳蒿湯的清熱利濕機(jī)制，推進(jìn)中醫(yī)藥治療溫病濕熱證的科學(xué)性的發(fā)展。
　　方法:
　　建立兩種不同發(fā)病機(jī)制的嶺南溫病濕熱證小鼠模型:通過(guò)運(yùn)用“高蛋白飼料+糖水”模擬嶺南飲食習(xí)慣特點(diǎn)，模型A組給予油脂灌胃模擬好食肥甘厚膩之人群，模型B組則給予番瀉葉灌胃模擬常服清熱解毒之品人群，酒的作用為加劇內(nèi)濕熱程度，綜合以上形成內(nèi)濕熱因素;氣候箱模擬嶺南外環(huán)境的濕度溫度，再加于LPS的腹腔注射

3、模擬外來(lái)戾氣，以“內(nèi)傷濕熱+外傷濕熱+外來(lái)疬氣”的模式建立嶺南溫病濕熱證小鼠模型，用HE染色法來(lái)觀察小鼠舌苔和結(jié)腸組織學(xué)的改變、用ELISA法檢測(cè)血清和結(jié)腸LPS、TNF-α的含量變化、用相對(duì)定量PCR法檢測(cè)小鼠糞便中五種腸道細(xì)菌的含量變化、用RT-PCR法檢測(cè)結(jié)腸組織TLR4、CD14、AQP3、AQP8的表達(dá)水平變化。選擇茵陳蒿湯對(duì)建立的兩種溫病濕熱證小鼠模型進(jìn)行反證治療，并通過(guò)血清TNF-α的含量的檢測(cè)和結(jié)腸組織TLR4、CD14

4、的表達(dá)變化來(lái)探索茵陳蒿湯清熱作用的炎癥信號(hào)通路機(jī)制，通過(guò)結(jié)腸組織AQP3、AQP8的表達(dá)變化來(lái)探索茵陳蒿湯利濕作用的機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　兩種嶺南溫病濕熱證小鼠模型均出現(xiàn)了濕熱證相關(guān)的癥狀體征，血清、結(jié)腸TNF-α均出現(xiàn)明顯升高(P＜0.05)，提示溫病濕熱證模型建模成功。模型完成初期(6h)，模型A組血清LPS含量低于單純LPS組(P＞0.05)，模型B組血清LPS含量低于單純LPS組(P＜0.05)，推測(cè)可能是兩組模型

5、均出現(xiàn)過(guò)腸道細(xì)菌移位入血，細(xì)菌LPS使機(jī)體產(chǎn)生了LPS耐受，引起模型組血液內(nèi)LPS含量降低;兩組模型結(jié)腸組織TLR4mRNA、CD14mRNA轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)升高，結(jié)腸組織AQP3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)降低，AQP8 mRNA轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)升高，提示了溫病濕熱證出現(xiàn)TLR4通路的激活和水通道蛋白表達(dá)的紊亂。
　　兩種溫病濕熱證模型腸道菌群的檢測(cè)結(jié)果顯示，兩組模型均出現(xiàn)大腸桿菌屬、腸球菌屬、梭菌屬含量增加，大腸桿菌屬含量升高最為明顯;雙

6、歧桿菌屬和乳桿菌屬含量的表達(dá)存在差別，模型A組雙歧桿菌屬和乳桿菌屬出現(xiàn)含量增加而模型B組雙歧桿菌屬和乳桿菌屬出現(xiàn)含量降低;以上提示溫病濕熱證存在腸道菌群的失調(diào)。
　　茵陳蒿湯的清熱機(jī)理探索，茵陳蒿湯治療7天后，治療組A組、治療組B組的小鼠相關(guān)濕熱證癥狀體征出現(xiàn)明顯改善。研究結(jié)果顯示，治療組A組、治療組B組血清中TNF-α含量均低于鹽水組A組、鹽水組B組(P＜0.05)，提示茵陳蒿湯有抗炎的效果;相比鹽水組A組、鹽水組B組，治療A組

7、、治療B組的結(jié)腸組織TLR4mRNA、CD14mRNA轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)不同程度的下降，提示茵陳蒿湯抗炎的作用機(jī)制之一是通過(guò)TLR4通路來(lái)下調(diào)TLR4mRNA、CD14 mRNA轉(zhuǎn)錄水平而實(shí)現(xiàn)，抗炎可能是茵陳蒿湯清熱作用的機(jī)制之一。
　　茵陳蒿湯的利濕機(jī)理探索，茵陳蒿湯治療7天后，治療組A組、治療組B組的小鼠飲水飲食量均出現(xiàn)不同程度的增加，糞便色褐質(zhì)軟硬適中，排便時(shí)糞便不伴有拖尾排不盡現(xiàn)象，提示了茵陳蒿湯能改善食少納呆、不欲飲、便溏軟

8、等濕熱證的癥狀體征;研究結(jié)果顯示，相比鹽水組A組、鹽水組B組，治療組A組、治療組B組結(jié)腸組織AQP3mRNA轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了不同程度的下調(diào)，治療組A組、治療組B組結(jié)腸組織AQP8mRNA轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)，提示茵陳蒿湯能調(diào)節(jié)水通道蛋白的表達(dá)量，茵陳蒿湯的利濕作用的機(jī)制之一是作用于結(jié)腸組織通過(guò)下調(diào)AQP3表達(dá)量和上調(diào)AQP8的表達(dá)量實(shí)現(xiàn)。
　　鹽水組A組、B組分別是模型A組、B組在自然發(fā)展?fàn)顟B(tài)下7天的表現(xiàn)。相比模型A組、B組

9、，鹽水組A組、B組TLR4mRNA、CD14 mRNA轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，提示溫病濕熱證TLR4通路的激活狀態(tài)隨著時(shí)間的進(jìn)展程度加重;鹽水組A組、B組AQP3mRNA轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，鹽水組A組、B組的AQP8mRNA轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)特異性，鹽水組A組出現(xiàn)AQP8mRNA轉(zhuǎn)錄水平上升，鹽水組B組出現(xiàn)AQP8mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降，提示可能溫病濕熱證水濕內(nèi)停的病理狀態(tài)的加重與AQP3、AQP8的表達(dá)改變有相關(guān)性。
　

10、　結(jié)論:
　　兩種嶺南特色溫病濕熱證小鼠模型造模成功，表現(xiàn)出相應(yīng)的溫病濕熱證癥狀體征。溫病濕熱證存在腸道菌群的失調(diào)狀態(tài)，濕熱證出現(xiàn)大腸桿菌屬、腸球菌屬、梭菌屬等條件致病菌過(guò)度增長(zhǎng)，而雙歧桿菌屬、乳桿菌屬等益生菌的含量受濕熱發(fā)病機(jī)制的影響出現(xiàn)含量表達(dá)的差異，可能致病菌的過(guò)度增殖是溫病濕熱證實(shí)質(zhì)的病理機(jī)制之一。溫病濕熱證的實(shí)質(zhì)存在TLR4受體通路的激活和AQP3、AQP8表達(dá)的紊亂。茵陳蒿湯具有治療溫病濕熱證的作用，茵陳蒿湯的清熱利濕