血管內(nèi)皮細胞核漿鈣信號調(diào)控機制.pdf

1、Ca2+作為細胞內(nèi)最為重要的第二信使之一,其濃度的變化可以引起一系列復雜細胞反應,對于細胞粘附、移動、擴增及基因表達等功能具有重要作用。鈣信號對于人體多種生理功能廣泛調(diào)節(jié)作用自發(fā)現(xiàn)以來已得到國內(nèi)外研究人員極大關注。隨著研究的深入,細胞內(nèi)各個獨立細胞器如細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體及溶酶體等的鈣信號變化及相關調(diào)控機制已成為該領域近年來的研究熱點;自1995年Gerasimenko等人發(fā)現(xiàn)核鈣信號以來,關于核鈣信號方面的調(diào)控研究一直存在爭議,特別

2、是核鈣信號是否具有一套不依賴于胞漿鈣信號的獨立調(diào)控體系這一問題,一直未得到闡明。
　　細胞核由核被膜及核孔復合物將其與細胞質(zhì)分離形成一個相對獨立的結構;通過核被膜鈣泵、ryanodine受體、IP3受體以及核孔復合物,細胞核可以發(fā)揮自主調(diào)節(jié)鈣信號能力,鈣離子通過主動運輸以及擴散進入或離開細胞核。核漿鈣信號目前已被證實在細胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄表達調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用。Rodrigues、Pusl等人研究證實核漿鈣信號被抑制后,肝癌細

3、胞或肝細胞系增殖被顯著抑制,這可能與E1k1轉(zhuǎn)錄因子激活受阻有關。核鈣信號也可以通過核因子NFAT影響基因轉(zhuǎn)錄,從而對后續(xù)一系列信號級聯(lián)反應產(chǎn)生作用;同時CREB, DREAM等介導的基因轉(zhuǎn)錄激活亦依賴于核漿鈣離子濃度升高。盡管人們對于核鈣信號的研究越來越深入,但是對于是否存在不依賴于胞漿鈣信號核漿鈣信號現(xiàn)象以及相關調(diào)控機制仍然存在爭議。目前研究人員發(fā)現(xiàn)可能參與到核漿鈣信號調(diào)控機制的有IP3、ryanodine及NAADP受體,核漿網(wǎng)及

4、鈣調(diào)蛋白等,其中IP3、ryanodine及NAADP受體均被證明參與到核內(nèi)鈣庫排空過程;核漿網(wǎng)與胞漿緊密連接,胞漿信號可通過其進入核內(nèi),且核漿網(wǎng)上存在有IP3及ryanodine受體,亦會對核漿鈣離子濃度變化產(chǎn)生影響;而鈣調(diào)蛋白與鈣離子綁定是大多數(shù)鈣離子介導細胞反應的必須步驟,且已發(fā)現(xiàn)鈣調(diào)蛋白核轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,說明其可能參與到核漿鈣信號調(diào)控過程中。
　　本次研究通過TG刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞后,再給予不同外鈣濃度平衡鹽溶液,觀察人臍靜脈

5、內(nèi)皮細胞隨外鈣濃度降低,胞漿與核漿鈣信號相對變化情況。研究發(fā)現(xiàn)胞漿鈣信號隨外鈣濃度降低而降低,而核漿鈣信號在達到一定閾值后獨立于胞漿鈣信號變化,不再降低;在較高外鈣濃度條件下,其獨立變化被胞漿鈣信號變化所掩蓋。這一實驗結果是獨立于胞漿鈣信號調(diào)控的核漿鈣信號調(diào)控存在的有力證據(jù)之一;研究進一步確定,在0.1mM外鈣濃度條件下,可以進行獨立于胞漿鈣信號的核漿鈣信號研究;在這一研究策略基礎上,我們對于人臍靜脈內(nèi)皮細胞這一獨立核鈣信號調(diào)控機制進行

6、了初步探索。已有研究表明,IP3受體及ryanodine受體可能參與到核漿鈣信號調(diào)控過程中,故本次研究中使用IP3受體抑制劑heparin、XeC及ryanodine受體抑制劑ryanodine分別作用于細胞,觀察處理后人臍靜脈內(nèi)皮細胞核漿與胞漿鈣信號相對變化。研究結果顯示ryanodine受體參與獨立于胞漿鈣信號調(diào)控的核鈣信號調(diào)控機制,而IP3受體并未參與。已有研究對于獨立于胞漿鈣信號調(diào)控的核漿鈣信號調(diào)控是否存在,以及核鈣信號相關調(diào)控

7、機制爭議較多,本次研究結果為證實獨立胞漿鈣信號存在,進一步深入研究核鈣信號調(diào)控相關作用機制提供了理論依據(jù)及新的線索。
　　目的:本次研究旨在探尋胞漿鈣信號非依賴性核漿鈣信號調(diào)控現(xiàn)象;確定獨立研究核漿鈣信號實驗策略;探討胞漿鈣信號非依賴性核漿鈣信號相關調(diào)控機制,并為更深入的核漿鈣信號調(diào)控研究奠定基礎。
　　方法:
　　1.采用0.25％胰蛋白酶消化法原代及傳代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞。
　　2.胞漿鈣信號非依賴性核漿鈣

8、信號現(xiàn)象探索:首先TG(thapsigargin)刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞,再給予不同細胞外鈣濃度(0.03mM/0.1mM/0.3mM/1mM/2mM) HBS溶液,通過共聚焦顯微鏡觀察隨細胞外鈣濃度降低,核漿鈣信號與胞漿鈣信號相對變化情況,并進行統(tǒng)計學比較,觀察是否存在胞漿鈣信號非依賴性核漿鈣信號現(xiàn)象存在。
　　3.胞漿鈣信號非依賴性核漿鈣信號調(diào)控機制探索:在上步實驗基礎上,選用0.1mM細胞外鈣濃度作為胞漿非依賴性核漿鈣信號調(diào)控

9、機制研究作用細胞外鈣濃度,分別給予heparin、XeC及ryanodine處理,與給予同樣處理2mM細胞外鈣濃度作用下細胞胞漿鈣信號與核漿鈣信號進行統(tǒng)計學比較,以證實IP3受體以及ryanodine受體是否參與到胞漿鈣信號非依賴性核漿鈣信號調(diào)控機制中。
　　結果:
　　1.人臍靜脈內(nèi)皮細胞TG處理后,胞漿鈣信號隨細胞外鈣濃度下降而下降,組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,n=214);核漿鈣信號在給予2mM,1mM及0

10、.3mM細胞外鈣濃度條件下隨細胞外鈣濃度下降而下降,組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,n=135);但在給予給予更低濃度(0.1mM Ca2+,0.03mM Ca2+)細胞外鈣條件下,核漿鈣信號與0.3mM細胞外鈣條件下比較無明顯變化,組間差異無統(tǒng)計學意義(P=NS,n=123)。
　　2.heparin處理組:0.1mM細胞外鈣條件下,給予TG處理后,heparin處理組細胞核漿鈣信號、胞漿鈣信號與對照組比較差異無統(tǒng)計學意

11、義(P=NS,n=84);2mM細胞外鈣條件下,給予TG處理后,heparin處理組細胞核漿鈣信號、胞漿鈣信號與對照組比較差異亦無統(tǒng)計學意義(P=NS,n=84)。
　　3.XeC處理組:0.1mM細胞外鈣條件下,給予TG處理后,XeC處理組細胞核漿鈣信號、胞漿鈣信號與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=NS,n=80);2mM細胞外鈣條件下,給予TG處理后,XeC處理組細胞核漿鈣信號、胞漿鈣信號與對照組比較差異亦無統(tǒng)計學意義(P=N

12、S,n=80)。
　　4.ryanodine處理組:0.1mM細胞外鈣條件下,給予TG處理后,ryanodine處理組細胞核漿鈣信號與對照組比較明顯被抑制,組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,n=86),胞漿鈣信號與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=NS,n=86);2mM細胞外鈣條件下,給予TG處理后,ryanodine處理組細胞核漿鈣信號與對照組比較明顯被抑制,組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,n=86),胞漿鈣信號與

13、對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=NS,n=86)。
　　結論:
　　1.在給予較高濃度外鈣條件下,血管內(nèi)皮細胞核漿鈣信號獨立變化被胞漿鈣信號變化所掩蓋;而較低細胞外鈣濃度刺激時,核漿鈣信號變化不依賴于胞漿鈣信號;存在胞漿鈣信號非依賴性核漿鈣信號現(xiàn)象,其調(diào)控獨立于胞漿鈣信號,具有自己獨特的調(diào)控機制;同時確立研究獨立于胞漿鈣信號核漿鈣信號調(diào)控機制實驗研究方法,即TG刺激后,在0.1mM細胞外鈣濃度條件下,觀察對照組與受體抑制劑處

14、理組細胞核漿與胞漿鈣信號相對變化情況,確定胞漿鈣信號非依賴性核漿鈣信號具體調(diào)控機制。
　　2.IP3受體被特異性抑制劑抑制后,TG刺激后給予0.1mM及2mM細胞外鈣條件下,核漿鈣信號、胞漿鈣信號與正常細胞比較均未受到明顯抑制;證明其未參與到胞漿鈣信號非依賴性核漿鈣信號調(diào)控機制中。
　　3.ryanodine受體被特異性抑制劑抑制后,TG刺激后給予0.1mM細胞外鈣條件下,核漿鈣信號與正常細胞比較明顯被抑制,而胞漿鈣信號比較