干預(yù)NF-κB信號通路對劃痕損傷后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：觀察干預(yù)NF-κB通路對劃痕損傷后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、自噬、凋亡和壞死的影響，進(jìn)一步闡明NF-κB在創(chuàng)傷性腦損傷后的作用機(jī)制，尋找調(diào)控創(chuàng)傷性腦損傷后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞繼發(fā)性死亡新的治療靶點(diǎn)。
　　 方法：取SPF級新生SD大鼠的腦皮層提取腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。經(jīng)傳代純化滿意后，將每批細(xì)胞平均分為空白組、激活組、抑制組、劃痕組、劃痕+激活組、劃痕+抑制組。激活組給予NF-κB激活劑PMA干預(yù)，抑制組在PDTC預(yù)處理后

2、加用PMA，劃痕+激活組和劃痕+抑制組則在劃痕損傷后分別按激活組和抑制組處理。各組細(xì)胞處理1h、6h、12h、24h、48h后，分別應(yīng)用免疫細(xì)胞熒光法測定磷酸化NF-κB p65的表達(dá)，應(yīng)用CellTiter96(@)AQueous單溶液細(xì)胞檢測試劑盒(MTS)檢測增殖，應(yīng)用Annexin V/PⅠ染色法檢測凋亡和壞死，應(yīng)用Westernblot檢測自噬蛋白LC3Ⅱ表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：⑴成功進(jìn)行了腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)，

3、經(jīng)免疫熒光鑒定純度在93％以上。⑵隨著作用時間增加，激活組、抑制組和三個劃痕模型組的NF-κB蛋白表達(dá)量逐漸增高，以24h改變最顯著。激活組1h～48h與空白組比較均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。抑制組1h～48h NF-κB蛋白表達(dá)均較激活組明顯減少，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。三個劃痕模型組間兩兩比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，劃痕+激活組＞劃痕組＞劃痕+抑制組，且劃痕+激活組的峰值提前至12h。⑶各組細(xì)胞均有不同

4、程度的增殖?？瞻捉M與抑制組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與其他各組比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)?？傮w上，激活組與劃痕+激活組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);但是從不同時間點(diǎn)上看，1h～12h前者高于后者，24h兩者接近(P＞0.05)，至48h后者則明顯高于前者(P＜0.01)。劃痕組與抑制組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。各組增殖比較:激活組、劃痕+激活組＞劃痕組、抑制組＞對照組＞劃痕+抑制組。⑷各組細(xì)胞均有不同程度的

5、凋亡，且隨著作用時間延長而增加。空白組與抑制組間、激活組與劃痕組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，其余組間兩兩比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。三組損傷模型細(xì)胞均高于空白組和抑制組(P＜0.01)，三組損傷模型細(xì)胞間比較，1h無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，自6h始兩兩比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。⑸各組細(xì)胞均有不同程度的壞死?？瞻捉M與抑制組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，其余各組兩兩比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。激

6、活組壞死程度總體高于空白組與抑制組，自1h始即與空白組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，于24h達(dá)到峰值。劃痕損傷模型組總體上明顯高于激活組，各時間點(diǎn)比較亦有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。三組劃痕損傷細(xì)胞在1h無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，6h～48h三組兩兩比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。⑹各組細(xì)胞均有不同程度的自噬?？瞻捉M與抑制組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，其余組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。在1h，激活組、劃

7、痕組、劃痕+激活組、劃痕+抑制組之間兩兩比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，但與空白組比較顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。劃痕損傷模型組自6h始三者兩兩比較顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。從時間上分析，總體上24h與48h比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，其余組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：通過對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB表達(dá)進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示:PMA誘導(dǎo)的NF-κB活化能夠啟動正常和劃痕損傷的腦微血管內(nèi)

8、皮細(xì)胞不同程度的凋亡、壞死及自噬進(jìn)程并促進(jìn)增殖，而PDTC能夠抑制激活NF-κB通路所誘導(dǎo)的這些死亡進(jìn)程并抑制增殖，但又不能完全阻斷這些進(jìn)程。同時，NF-κB通路激活后，早期細(xì)胞以凋亡和自噬這種細(xì)胞自我保護(hù)形式為主，到晚期細(xì)胞炎癥因子大量表達(dá)后，凋亡和自噬表達(dá)過度，細(xì)胞則以壞死為主。推測早期合理使用NF-κB抑制藥物（如PDTC）和激活藥物(如PMA)可以有效減輕受損腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB通路引起的細(xì)胞死亡程度，促進(jìn)細(xì)胞增殖，有可能