窖蛋白caveolin-1-3對(duì)心肌細(xì)胞容積敏感性氯離子通道功能的影響.pdf

1、容積敏感性氯離子通道全稱容積敏感性、外向整流性氯離子通道（volume-sensitive outward rectification chloride channel，VSOR Cl-channel），也被稱為容積調(diào)節(jié)的陰離子通道（volume-regulated anion channel，VRAC），大量分布在哺乳動(dòng)物組織和細(xì)胞，參與了調(diào)節(jié)細(xì)胞體積、細(xì)胞增殖與分化、免疫反應(yīng)、細(xì)胞膜電位、細(xì)胞內(nèi)PH及凋亡等多種病理、生理過(guò)程。而且它

2、還參與了多種心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展，如：阻斷VSOR Cl-通道可以延長(zhǎng)動(dòng)電位時(shí)程、心肌不應(yīng)期而預(yù)防惡性心律失常，可以減輕缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷，抑制心肌肥厚，還可以減少梗死心肌的范圍，恢復(fù)心臟基本功能等。因此干預(yù)及調(diào)節(jié)VSOR Cl-通道的功能，能成為保護(hù)心肌的靶點(diǎn)。近年來(lái)由于對(duì)該通道的不斷深入研究，VSOR Cl-通道的主要編碼蛋白LRRC8A于2014年首次被發(fā)現(xiàn)了，為進(jìn)一步研究VSOR Cl-通道打下了堅(jiān)定的基礎(chǔ)。

3、r>　　最新研究表明VSOR Cl-通道不是直接被機(jī)械應(yīng)力刺激激活，而是涉及了離子強(qiáng)度和細(xì)胞膜的緊張度的敏感性。該通道的激活不僅涉及到了胞內(nèi)Ca2+及ATP水平，還涉及到窖蛋白（caveolin，Cav）、細(xì)胞膜的脂質(zhì)構(gòu)成、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和G蛋白等。而且研究發(fā)現(xiàn)，不僅離子通道本身，與之相結(jié)合的蛋白結(jié)構(gòu)的異常和（或）功能的改變均可導(dǎo)致一系列的病理變化。其中發(fā)揮膜儲(chǔ)備作用的caveolin，也是最常見(jiàn)的細(xì)胞質(zhì)膜上的離子通道結(jié)合蛋白。研究指

4、出，caveolin可以和陽(yáng)離子通道K+，Na+， Ca2+等形成復(fù)合物，caveolin結(jié)構(gòu)的改變及功能的異常，可以引起上述這些離子通道功能的異常，甚至引起系統(tǒng)疾病、離子通道病等。然而僅有幾例關(guān)于caveolin與陰離子通道關(guān)系的報(bào)道，目前尚無(wú)caveolin與VSOR Cl-通道編碼蛋白關(guān)系及其相關(guān)機(jī)制的研究。
　　因此，本研究擬：
　?。?）探討VSOR Cl-通道編碼蛋白LRRC8A在細(xì)胞膜上的具體定位，及其與cav

5、eolin的定位關(guān)系；
　?。?）進(jìn)一步說(shuō)明caveolin對(duì)VSOR Cl-通道功能的影響，是否調(diào)控了VSOR Cl-通道的開(kāi)放，及如何發(fā)揮調(diào)控作用的？
　　目的：
　　1.探討Cav-1/3與LRRC8A在心肌細(xì)胞膜上的定位及二者定位關(guān)系。
　　2.探討Cav-1/3是否對(duì)心肌細(xì)胞VSOR Cl-通道的功能產(chǎn)生影響。
　　3.探討Cav-1/3對(duì)VSOR Cl-編碼蛋白LRRC8A表達(dá)水平的影響。

6、>　　方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)分組：等滲刺激，低滲刺激，實(shí)驗(yàn)組（低滲刺激＋DIDS/低滲刺激+MβCD），Cav-1/3 siRNA+等滲刺激，Cav-1/3 siRNA+低滲刺激；
　　2.乳鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)：常規(guī)分離乳鼠心臟、剪碎、消化、離心、重懸、差速貼壁及培養(yǎng)備用；
　　3.免疫熒光染色檢測(cè)心肌細(xì)胞膜上LRRC8A、Cav-1及Cav-3的定位；
　　4.蔗糖密度超速離心技術(shù)：獲取富含cveolin的片段

7、；
　　5.Western blot蛋白檢測(cè)技術(shù)：檢測(cè)目的蛋白LRRC8A，Cav-1，Cav-3的表達(dá)水平；
　　6.免疫共沉淀技術(shù)：檢測(cè)目的蛋白LRRC8A與Cav-1，及LRRC8A與Cav-3有無(wú)共沉淀；
　　7.膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)：檢測(cè)等滲、低滲、加入VSOR Cl-通道非特異性阻滯劑DIDS及caveolin破壞劑MβCD處理后，心肌細(xì)胞上ICl,vol電流的變化。
　　8. siRNA基因沉默技術(shù)

8、：含Cav-1或Cav-3基因的siRNA片段轉(zhuǎn)染H9C2心肌細(xì)胞系48-72h，重新貼壁，膜片鉗檢測(cè)ICl,vol電流的變化；及Western blot檢測(cè)LRRC8A膜蛋白隨著Cav-1基因沉默的變化。
　　9.流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)：對(duì)H9C2心肌細(xì)胞系在等滲、低滲、低滲+MβCD等不同條件下檢測(cè)心肌細(xì)胞容積的變化，并繪制曲線圖。
　　10.MQAE氯離子熒光檢測(cè)技術(shù)：心肌細(xì)胞在等滲、低滲、低滲+DIDS、低滲+MβCD不同

9、條件下，觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化及全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)不同組熒光值的變化。
　　11.Cav-1基因過(guò)表達(dá)、轉(zhuǎn)染技術(shù)：構(gòu)建pCMV-myc-Cav-1載體、質(zhì)粒合成、轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞系（H9C2），Western blot檢測(cè)LRRC8A膜蛋白隨著Cav-1蛋白過(guò)表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　1.免疫熒光染色技術(shù)顯示：熒光倒置顯微鏡下觀察，Cav-1/3（紅色），LRRC8A（綠色），黃色即提示二者分布一致，結(jié)果顯示Cav-1/

10、3與LRRC8A存在共定位關(guān)系。
　　2.選取原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，利用蔗糖密度超速離心法，按照超聲離心物分層的結(jié)果，分別獲取1-12份不同比重的細(xì)胞沉淀物，離心、提取蛋白后，蛋白免疫印跡法顯示：Cav-1、Cav-3與LRRC8A均分布在相同比重的膜窖富集區(qū)條帶，并形成免疫共沉淀復(fù)合物，提示二者Cav-1/3與LRRC8A存在直接接觸的基礎(chǔ)。
　　3.低于正常滲透壓的外液（220 Osmol/kgH2O）灌流心肌細(xì)胞，VSO

11、R Cl-通道被激活，ICl,Vol電流逐漸增大并穩(wěn)定，電壓達(dá)到+80mV及以上時(shí)，具有時(shí)間、電壓依賴性失活，+100mV時(shí)計(jì)算ICl,Vol的密度為98.45±1.76pA/pF（n=5），在+40mV，+60mV，+80mV及+100mV時(shí)均可被DIDS呈電壓依賴性阻斷，I/V曲線提示該電流呈外向整流性，+100mV對(duì)ICl,Vol電流的抑制率為90.22±11.50％（P＜0.01 vs HYPO，n=5）。
　　4.同樣低

12、于正常滲透壓的外液（220 Osmol/kgH2O）灌洗原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，記錄到陽(yáng)性ICl,Vol電流后，再加入含有10mmol/L MβCD的低滲外液后，該電流在+40mV，+60mV，+80mV及+100mV時(shí)也可被MβCD呈電壓依賴性阻斷，+100mV時(shí)的電流密度為36.57±10.46 pA/pF，抑制率為91.86±12.70%（P＜0.01 vs HYPO，n=3）。
　　5.含2.5mmol/L MβCD的培養(yǎng)液預(yù)

13、孵育細(xì)胞半小時(shí)，實(shí)驗(yàn)前給予含有相同濃度MβCD的低滲外液，記錄到的 ICl,Vol電流明顯減少，在+40mV，+60mV，+80mV及+100mV時(shí)，該電流呈現(xiàn)出明顯的電壓依賴性阻斷，+100mV時(shí)的電流密度為25.95±4.75pA/pF，MβCD對(duì)ICl,Vol的抑制率為89.19±8.35%（P＜0.01 vs HYPO， n=4）。
　　6.應(yīng)用Cav-1的siRNA及Cav-3的siRNA處理H9C2心肌細(xì)胞系72h后，

14、置低滲灌流液中，在siRNA沉默Cav-1組，未能記錄到陽(yáng)性電流，+100mV時(shí)的電流密度為28.53±7.04pA/pF，抑制率達(dá)到78.27±7.93%（n=4，P＜0.01 vs HYPO），而在siRNA沉默Cav-3組，可記錄到陽(yáng)性ICl,Vol電流，+100mV時(shí)的電流密度為77.85±3.04pA/pF，較低滲組無(wú)明顯差異（P＞0.05 vs HYPO，n=4）。
　　7.在等滲、低滲、低滲+MβCD等不同條件下處理

15、H9C2細(xì)胞1h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞體積，結(jié)果顯示：與低滲組比較，低滲+MβCD組細(xì)胞體積未見(jiàn)明顯增大，提示caveolin可能通過(guò)干預(yù)VSPR Cl-通道的功能，而發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞體積的作用。
　　8.應(yīng)用MQAE檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Cl-濃度，結(jié)果顯示：低滲組熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，低滲+DIDS組及低滲+MβCD組熒光強(qiáng)度均較低滲組明顯減弱（P＜0.01，n=6），而低滲+DIDS組與低滲+MβCD組比較，胞內(nèi)Cl-熒光強(qiáng)度相當(dāng)，無(wú)統(tǒng)計(jì)差異（P＞

16、0.05，n=6）。
　　9.應(yīng)用Cav-1的siRNA處理后，LRRC8A膜蛋白相應(yīng)減少，統(tǒng)計(jì)存在顯著性差異（P＜0.05，n=6）；過(guò)表達(dá)Cav-1后，LRRC8A膜蛋白表達(dá)無(wú)明顯增加，統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著差異（P＞0.05，n=6）。
　　結(jié)論：
　　1.Cav-1/3與LRRC8A位于心肌細(xì)胞的膜窖內(nèi)，呈現(xiàn)共定位關(guān)系。
　　2.破壞及干擾掉caveolin，可以顯著減弱低滲刺激下心肌細(xì)胞的容積敏感性氯電流、阻止了