MiR-1-133對(duì)病毒性心肌炎心肌細(xì)胞離子通道表達(dá)及心功能的影響.pdf

1、MiRNAs是一類內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，大約由20～23個(gè)核苷酸組成。在動(dòng)植物和人類體內(nèi)，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控基因的表達(dá)，參與機(jī)體一系列的生理病理過(guò)程。研究表明，在人類基因組中，1/3的基因受miRNAs的調(diào)節(jié)。miRNAs在體內(nèi)穩(wěn)定存在，不易被降解。miRNA具有組織特異性和空間特異性，這決定了不同的miRNAs在機(jī)體不同發(fā)育階段具有不同的作用。一種miRNA有多個(gè)作用靶點(diǎn)mRNAs，一個(gè)mRNA的表達(dá)受多種miRNAs的調(diào)節(jié)和

2、控制。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展和人類對(duì)疾病的不斷認(rèn)識(shí)，miRNAs參與的研究范圍越來(lái)越廣泛，將來(lái)可作為某些疾病的治療靶點(diǎn)。miR-1、miR-133為肌肉特異性miRNAs，具有心肌特異性且在心肌中豐富表達(dá)，兩者為相似的轉(zhuǎn)錄單位，通過(guò)調(diào)控靶基因參與心臟發(fā)育、心律失常、細(xì)胞凋亡、心肌肥厚等許多心血管系統(tǒng)的生理及病理過(guò)程。
　　病毒性心肌炎是兒科常見(jiàn)病，其心電圖常表現(xiàn)為類型不同的心律失常。急性重癥心肌炎可引起致死性心律失常、心力衰竭，

3、從而導(dǎo)致患兒死亡。病毒侵入心肌可引起細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致心功能的衰竭。實(shí)驗(yàn)表明miR-1和miR-133與細(xì)胞凋亡有關(guān)，且促凋亡相關(guān)基因caspase-9是miR-133的作用靶點(diǎn)，但miR-1/133對(duì)心肌炎心肌細(xì)胞凋亡的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。電重構(gòu)與心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)是心律失常發(fā)生的主要機(jī)制。鉀離子和鈣離子通道是心肌細(xì)胞膜主要的離子通道。研究已經(jīng)表明在病毒性心肌炎小鼠模型的心肌中miRNAs表達(dá)譜存在異常，且異常表達(dá)的miRNAs通過(guò)作用于不同的靶點(diǎn)

4、及傳導(dǎo)途徑參與不同的病理過(guò)程。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)miR-1能夠穩(wěn)定靜息膜電位鉀電流Kir2.1、控制鉀電流Kv4.2mRNA的表達(dá);miR-133可靶向性調(diào)節(jié)L型鈣通道亞單位Cav1.2的表達(dá)，這提示miR-1、miR-133對(duì)心肌細(xì)胞電活動(dòng)可能具有重要的調(diào)節(jié)功能。
　　RNA干擾是目前治療心肌炎的研究熱點(diǎn)，RNA干擾面臨兩大難題:一是如何解決病毒通過(guò)基因變異逃避藥物的抑制作用，二是如何靶向性的將miRs導(dǎo)入被病毒感染的心肌細(xì)胞發(fā)揮抗

5、病毒作用。對(duì)此研究者發(fā)現(xiàn)人工合成的miRs類似物有很好的對(duì)抗病毒基因變異能力，且安全性更高;同時(shí)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合兩種miRs干擾可明顯減少病毒逃逸。研究發(fā)現(xiàn)將熒光標(biāo)記的miR-1與miR-133充分混勻，包被于RNA-LANCErⅡ轉(zhuǎn)染試劑中可以增強(qiáng)其靶向性，通過(guò)小鼠尾靜脈注射可成功到達(dá)心肌組織。
　　目的：
　　1、探討miR-1、miR-133是否能夠減少急性病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞的凋亡并改善心功能EF、FS。
　　2、

6、探討miR-1、miR-133是否調(diào)控急性病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞鉀離子、鈣離子通道基因和蛋白的表達(dá)，從而減少心律失常的發(fā)生。
　　方法
　　1、采用腹腔注射柯薩奇病毒CVB3 Nancy株建立急性病毒性心肌炎Balb/c小鼠模型，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、心肌炎組、心肌炎+ miR-1/133mimics組、心肌炎+ miR-1/133NC組，每組10只。建模后第2天分別給小鼠尾靜脈注射miR-1/133復(fù)合類似物(miR-1

7、/133mimics)和miR-1/133陰性對(duì)照(miR-1/133NC)。觀察各組小鼠的一般情況。
　　2、超聲心動(dòng)圖測(cè)定各組小鼠的左室射血分?jǐn)?shù)(EF)和左室短軸縮短率(FS)。3、采用HE染色法觀察各組小鼠的心肌形態(tài)學(xué)改變。
　　4、采用TUNEL法觀察各組小鼠的心肌細(xì)胞凋亡情況。
　　5、采用實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR法檢測(cè)各組小鼠心肌組織miR-1、miR-133的相對(duì)表達(dá)量;檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax、

8、Bcl-2、Caspase-9的相對(duì)表達(dá)量;檢測(cè)心肌組織瞬時(shí)外向鉀電流Ito通道基因Kcnd2、其轉(zhuǎn)錄抑制基因Irx5及內(nèi)向整流鉀電流Ik1通道基因Kcnj2的相對(duì)表達(dá)量;檢測(cè)心肌L型鈣離子通道亞單位基因α1c的相對(duì)表達(dá)量;
　　6、采用western blot法檢測(cè)各組小鼠心肌組織中鉀通道基因Kcnd2的靶蛋白 Kv4.2和基因Kcnj2的靶蛋白Kir2.1的相對(duì)表達(dá)量;檢測(cè)心肌L型鈣離子通道亞單位基因α1c的靶蛋白Cav1.2

9、的相對(duì)表達(dá)量。
　　結(jié)果
　　1、小鼠于腹腔注射柯薩奇病毒CVB3 Nancy株104TCID500.1mL后第2天，出現(xiàn)蜷縮，毛發(fā)無(wú)光澤、凌亂，易激惹，或者對(duì)刺激不敏感，活動(dòng)減少，體重減輕。給予miR-1/133NC的小鼠的癥狀未見(jiàn)明顯改變。給予miR-1/133mimics的小鼠毛發(fā)較前整齊、有光澤，活動(dòng)增加，體重增加。心肌炎組與心肌炎+miR-1/133 NC組小鼠的心臟較對(duì)照組小鼠的心臟大，表面有壞死灶。對(duì)照組小鼠一

10、般情況未見(jiàn)明顯變化。
　　2、超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，心肌炎組和心肌炎+miR-1/133 NC組小鼠的心功能EF、FS下降(P＜0.01);miR-1/133mimics能改善心肌炎小鼠的心功能EF、FS(P＜0.01)。
　　3、HE染色顯示:對(duì)照組小鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞無(wú)水腫，間質(zhì)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);心肌炎組與心肌炎+miR-1/133NC組心肌細(xì)胞水腫、排列紊亂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)間質(zhì);心肌炎+miR-1/133

11、mimics組心肌細(xì)胞排列較整齊，無(wú)細(xì)胞水腫，間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　4、TUNEL染色結(jié)果示:對(duì)照組與心肌炎+miR-1/133mimics組凋亡的心肌細(xì)胞少，心肌炎組與心肌炎+miR-1/133NC組心肌細(xì)胞凋亡明顯增多。
　　5、實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR結(jié)果顯示:
　　(1)與對(duì)照組相比，心肌炎組與心肌炎+miR-1/133NC組心肌組織miR-1、miR-133表達(dá)明顯下調(diào)(P≮0.01)，miR-1/1

12、33mimics干預(yù)可上調(diào)其表達(dá)（P＜0.05）。
　　(2)與對(duì)照組相比，心肌炎組與心肌炎+miR-1/133 NC組心肌組織抑凋亡相關(guān)基因Bcl-2表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），而促凋亡相關(guān)基因Bax、Caspase-9表達(dá)上調(diào)（P＜0.01,P＜0.05）。miR-1/133 mimic可上調(diào)Bcl-2的表達(dá)（P＜0.05），下調(diào)Caspase-9、Bax的表達(dá)(P＜0.05,P＜0.01)。
　　(3)與對(duì)照組相比，心肌

13、炎組與心肌炎+miR-1/133 NC組心肌組織鉀離子通道基因Kcnd2、Kcnj2mRNA表達(dá)下調(diào)(P＜0.01)，miR-1/133mimics干預(yù)可上調(diào)其基因表達(dá)(P＜0.05)。
　　(4)與對(duì)照組相比，心肌炎組與心肌炎+miR-1/133 NC組心肌組織鉀離子通道轉(zhuǎn)錄抑制基因Irx5mRNA表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)，miR-1/133mimics干預(yù)可下調(diào)其表達(dá)（P＜0.05）。
　　(5)與對(duì)照組相比，心肌炎組與

14、心肌炎+miR-1/133NC組小鼠心肌組織L型鈣離子通道基因α1cmRNA表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)，miR-1/133mimics可下調(diào)其表達(dá)(P＜0.05)。
　　6、Western blot結(jié)果顯示:
　　(1)與對(duì)照組相比，心肌炎組與心肌炎+miR-1/133NC組心肌組織鉀離子通道蛋白Kv4.2、Kir2.1的表達(dá)量明顯下調(diào)(P＜0.01)，miR-1/133mimics可上調(diào)其表達(dá)（P＜0.05）。
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