益氣養(yǎng)陰法中藥防治非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的系統(tǒng)評(píng)價(jià)及其分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　肺癌是當(dāng)今臨床中最為常見(jiàn)的惡性腫瘤，且其發(fā)病率仍在逐年上升，國(guó)內(nèi)外的致死率也是居高不下。在肺癌的分型中，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80％～85％，手術(shù)切除仍是目前NSCLC最有效且最好的方法，但僅僅只有20％ NSCLC患者適宜手術(shù)治療。目前按照最新的NCCN指南，NSCLC術(shù)后應(yīng)予常規(guī)的輔助化療，以鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的術(shù)后輔助化療目前已成為早期和中期患者的主要治療方法，諸多臨床研究也已表明化療能夠起一定程度

2、上到延長(zhǎng)生存期、抑制瘤體生長(zhǎng)的作用。但對(duì)于遠(yuǎn)期控制復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、延長(zhǎng)無(wú)病生存期以及改善患者癥狀及生存質(zhì)量方面，中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)還是非常明顯的。
　　惡性腫瘤的病因病機(jī)復(fù)雜，氣、血、痰、瘀、毒、虛等致病因素可以大致概括癌病的中醫(yī)病機(jī)。對(duì)于大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌病人來(lái)講，一般發(fā)現(xiàn)便已是中晚期，病程遷延日久正氣虛損，故氣陰兩虛的證候體現(xiàn)是最為明顯的。因此益氣養(yǎng)陰法中藥治療是對(duì)于NSCLC患者一個(gè)有效的治療方案，而結(jié)合國(guó)際上公認(rèn)的化療方案進(jìn)行中西醫(yī)結(jié)

3、合治療是目前最為常用的方法，也取得了比較明顯的療效。在益氣養(yǎng)陰法中藥當(dāng)中，肺瘤平膏作為臨床及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)均研究較多的藥物，其防治肺癌轉(zhuǎn)移的效果已被廣泛認(rèn)可，但是對(duì)其分子機(jī)制的研究還不夠深入。
　　目前最新研究認(rèn)為，腫瘤微環(huán)境可以改變腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能，因而從微觀整體性方面來(lái)調(diào)控腫瘤微環(huán)境以防治腫瘤轉(zhuǎn)移的方法越來(lái)越受到各方面重視。腫瘤微環(huán)境的兩大核心是免疫與炎癥，微環(huán)境內(nèi)癌成分及非癌成分各自發(fā)揮著促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移及抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移的不同作用，而益

4、氣養(yǎng)陰法中藥肺瘤平膏究竟在此系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮著怎樣的作用也是值得研究的。因此，本研究實(shí)驗(yàn)部分建立腫瘤免疫-炎性共培養(yǎng)模型，制備肺瘤平膏含藥血清，觀察其是否對(duì)微環(huán)境內(nèi)癌成分（LL/2-luc-M38細(xì)胞）與非癌成分（DC、RAW264.7細(xì)胞）中的關(guān)鍵信號(hào)通路PI3K/AKT/NF-κB的表達(dá)起到不同的調(diào)節(jié)作用，從而達(dá)到防治肺癌轉(zhuǎn)移的作用。
　　研究目的：
　　1.旨在分析評(píng)價(jià)益氣養(yǎng)陰法中藥在非小細(xì)胞肺癌患者中的療效和安全性及應(yīng)用前

5、景。
　　2.選用益氣養(yǎng)陰法的代表藥物肺瘤平膏進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，探討其對(duì)于腫瘤免疫-炎性微環(huán)境中的癌成分與非癌成分的調(diào)節(jié)作用，觀察其是否對(duì)微環(huán)境內(nèi)兩種成分的關(guān)鍵信號(hào)通路PI3 K/AKT/NF-κB的表達(dá)起到雙向調(diào)節(jié)作用，從而探討其預(yù)防肺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.本研究前半部分采用系統(tǒng)評(píng)價(jià)方法，對(duì)益氣養(yǎng)陰中藥療法治療NSCLC患者的療效及安全性進(jìn)行有效的評(píng)價(jià)。運(yùn)用Cochrane協(xié)作網(wǎng)的系統(tǒng)評(píng)價(jià)方法進(jìn)行匯

6、總分析，查閱國(guó)內(nèi)外知名的幾大文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，搜集益氣養(yǎng)陰法治療NSCLC的隨機(jī)對(duì)照臨床研究文獻(xiàn)，運(yùn)用Revman軟件作定量合并分析（meta分析），并最終評(píng)價(jià)益氣養(yǎng)陰法在治療中晚期非小細(xì)胞肺癌中的地位及為其療效和安全性提供依據(jù)。
　　2.本研究實(shí)驗(yàn)部分選用了在臨床中已廣泛應(yīng)用的益氣養(yǎng)陰法代表中成藥肺瘤平膏作為實(shí)驗(yàn)藥物，進(jìn)行體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)。
　　(1)通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)肺瘤平膏對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫功能的影響:首先

7、對(duì)觀察肺瘤平膏對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠脾臟DC的調(diào)節(jié)作用，然后研究其對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠脾臟TAM亞型的調(diào)節(jié)作用
　　(2)建立小鼠髓系樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)體外培養(yǎng)，并通過(guò)光鏡、電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)其生物學(xué)特征。然后進(jìn)行肺瘤平膏含藥血清的制備，為體外實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　(3)利用流式細(xì)胞儀研究肺瘤平膏含藥血清對(duì)腫瘤免疫及炎性微環(huán)境中的非癌成分（DC及RAW264.7細(xì)胞）表型的影響:包括肺瘤平膏含藥血清對(duì)C5

8、7BL/6小鼠髓系DC表型的影響及肺瘤平膏含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞數(shù)量及表型的影響。
　　(4)通過(guò)Western blot與實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法，研究肺瘤平膏含藥血清對(duì)腫瘤免疫及炎性微環(huán)境中癌成分與非癌成分PI3K/AKT/NF-κB表達(dá)的影響:首先建立腫瘤免疫共培養(yǎng)微環(huán)境，觀察肺瘤平膏含藥血清對(duì)免疫共培養(yǎng)微環(huán)境中LL/2-luc-M38細(xì)胞與髓系DC中PI3K/AKT/NF-κB表達(dá)的影響;其次建立腫瘤炎性共培養(yǎng)微環(huán)境

9、，觀察肺瘤平膏含藥血清對(duì)炎性共培養(yǎng)微環(huán)境中LL/2-luc-M38細(xì)胞與RAW264.7細(xì)胞中PI3K/AKT/NF-κB表達(dá)的影響。最終研究肺瘤平膏含藥血清是否對(duì)腫瘤細(xì)胞（癌成分）與DC、RAW264.7細(xì)胞（非癌成分）中的關(guān)鍵信號(hào)通路PI3K/AKT/NF-κB起著雙向調(diào)節(jié)作用。
　　研究結(jié)果：
　　1.從系統(tǒng)評(píng)價(jià)的最終結(jié)果來(lái)分析，益氣養(yǎng)陰法中藥聯(lián)合化療治療非小細(xì)胞肺癌對(duì)比單獨(dú)應(yīng)用化療，在近期有效率的提升、生存質(zhì)量的改善

10、、骨髓毒性反應(yīng)的降低及中醫(yī)癥候的改善方面均有明顯效果，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.肺瘤平膏含藥血清對(duì)腫瘤免疫及炎性微環(huán)境中非癌成分的影響:肺瘤平膏對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠脾臟DC及脾臟TAM亞型的調(diào)節(jié)作用:脾臟DC在單純荷瘤的小鼠中(Model組)數(shù)量由4.26％逐漸降低到2.59％，F(xiàn)LP組（肺瘤平膏灌胃）小鼠的DC數(shù)量在14d、21d、28d，分別為5.39％、4.83％、4.15％。相對(duì)于DC的低數(shù)量而言，M1、M2巨

11、噬細(xì)胞及其比值在上述兩組中均相對(duì)較高。M1型巨噬細(xì)胞（Model組）數(shù)量由8.59％逐漸上升到25.98％，同時(shí)M2型數(shù)量由0.92％逐漸上升到5.42％，M1/M2由9.34下降至4.79;對(duì)于FLP組荷瘤小鼠，在21d時(shí)，兩型巨噬細(xì)胞數(shù)量分別為23.16％及2.77％，數(shù)值較高，而M1/M2比值分別在3個(gè)日期時(shí)則分別為7.86、8.36、9.62。
　　3.肺瘤平膏含藥血清對(duì)C57BL/6小鼠髓系DC表型的影響:觀察流式細(xì)胞儀

12、顯示DC所表達(dá)的CD11c、MHCⅡ類(lèi)分子中，CD11c/MHC-Ⅱ?yàn)?0.59％、CD11c/CD80為66.01％（肺瘤平膏組），其與空白組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）;肺瘤平膏含藥血清對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞數(shù)量及表型的影響:RAW264.7細(xì)胞在經(jīng)過(guò)IL-4處理后通過(guò)流式細(xì)胞儀觀察:肺瘤平膏血清組M1/M2的比例較空白組明顯升高(5.25)，F(xiàn)4/80-CD16/32及F4/80-CD206的比例分別為12.14％、2.

13、31％，與空白組相比下降程度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4.肺瘤平膏含藥血清在免疫共培養(yǎng)微環(huán)境中的對(duì)于癌成分與非癌成分中的PI3K/AKT/NF-κB表達(dá)的不同影響:運(yùn)用Western blot及實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法檢測(cè):LL/2-luc-M38在腫瘤-免疫共培養(yǎng)環(huán)境中，PI3K、AKT、NF-κB的蛋白與基因的表達(dá)被肺瘤平膏含藥血清組(FLP-S)所抑制，而其對(duì)于NF-κB的抑制最為明顯;DC細(xì)胞在腫瘤-免疫共培養(yǎng)環(huán)境

14、中，其PI3K、AKT、NF-κB的蛋白與基因的表達(dá)能夠被FLP-S促進(jìn)，而其對(duì)于PI3K表達(dá)最為明顯。肺瘤平膏含藥血清在炎性共培養(yǎng)微環(huán)境中癌成分與非癌成分中的PI3K/AKT/NF-κB表達(dá)的不同影響: LL/2-luc-M38在腫瘤-炎性共培養(yǎng)環(huán)境中，PI3K、AKT、NF-κB的蛋白及mRNA基因的表達(dá)均能夠被肺瘤平膏含藥血清(FLP-S)所抑制，而其對(duì)于PI3K、NF-κB的抑制最為明顯;RAW264.7細(xì)胞在此共培養(yǎng)環(huán)境中，P

15、I3K、AKT、NF-κB的mRNA基因表達(dá)及AKT、NF-κB蛋白表達(dá)均被均FLP-S所促進(jìn)，以NF-κB的基因提升最為明顯（P＜0.01），僅有PI3K的蛋白表達(dá)較前降低。
　　研究結(jié)論：
　　1.益氣養(yǎng)陰法中藥對(duì)于非小細(xì)胞肺癌的治療作用還是值得肯定的，其聯(lián)合化療的治療方案在生存期、毒副反應(yīng)、生存質(zhì)量、中醫(yī)癥候改善等方面均較單獨(dú)化療有明顯的優(yōu)勢(shì)。因此，今后無(wú)論從安全性或是療效方面來(lái)看，益氣養(yǎng)陰法中藥是值得繼續(xù)在臨床中推廣

16、應(yīng)用的。
　　2.肺瘤平膏對(duì)于腫瘤微環(huán)境中非癌成分的影響主要在于對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的數(shù)量的調(diào)節(jié)作用，使荷瘤小鼠的免疫系統(tǒng)處于平衡穩(wěn)定的狀態(tài)。
　　3.肺瘤平膏含藥血清可以提高髓系DC的數(shù)量，并且可以促進(jìn)髓系DC的發(fā)育。從肺瘤平膏含藥血清對(duì)RAW264.7細(xì)胞的活化方向來(lái)看，其并不是僅抑制M2型巨噬細(xì)胞，而且對(duì)M1型巨噬細(xì)胞也有抑制作用，其在調(diào)節(jié)M1、M2的同時(shí)，以抑制M2型巨噬細(xì)胞為優(yōu)勢(shì)明顯。
　　4.肺瘤平膏含藥