益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥防治早期糖尿病腎病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最主要的微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)的首位病因。DN的病理表現(xiàn)主要為腎小球肥大，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellulaurmatrix，ECM)增生，腎小球系膜區(qū)增寬及毛細(xì)血管基底膜增厚，最后進(jìn)展至腎小球硬化。其發(fā)病機(jī)制涉及遺傳、糖代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)改變、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等多種因素環(huán)節(jié)。DN

2、的防治至今尚無(wú)有效手段。而中醫(yī)藥對(duì)DN的防治存在著巨大潛力。我們根據(jù)中醫(yī)學(xué)病機(jī)理論，并結(jié)合臨床實(shí)踐，逐步認(rèn)識(shí)到消渴日久，纏綿不愈，傷陰耗氣，氣陰兩虛為本病基本病機(jī)，久病入絡(luò)，由氣陰兩虛而致之痰、瘀、濕交阻絡(luò)脈，深伏于腎絡(luò)，漸成微小癥積而發(fā)為本病。鑒于此，我們提出“益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)法”治療DN，并依法組方。我們前期的臨床及實(shí)驗(yàn)研究，均取得了較好的療效。本研究繼續(xù)從臨床和實(shí)驗(yàn)兩個(gè)角度進(jìn)行更深入的研究，以氧化應(yīng)激、JNK信號(hào)通路和細(xì)胞凋亡相關(guān)

3、蛋白Caspase-3作為切入點(diǎn)，與目前歐盟批準(zhǔn)用于治療DN的藥物厄貝沙坦從以上方面進(jìn)行比較，繼續(xù)進(jìn)行中藥多途徑、多靶點(diǎn)治療DN的探索性實(shí)驗(yàn)研究，旨在尋找一條治療DN的有效方法。
　　方法：
　　1益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥治療早期糖尿病腎病的臨床研究
　　選擇Ⅲ期DN患者78例，將病例隨機(jī)分為益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥組(治療組)39例和厄貝沙坦組(對(duì)照組)39例。治療組予益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥，每日1付，水煎400ml，分2次口

4、服；對(duì)照組予厄貝沙坦150mg/次，1次/d。觀察1年。所有患者于用藥前和療程結(jié)束后分別檢測(cè)尿白蛋白排泄率(UAER)及血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、血脂(TC、TG)并觀察終點(diǎn)事件發(fā)生率，記錄患者的癥狀、體征及積分情況。
　　2益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用
　　健康雄性SD大鼠45只，體重為120g～150g，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，檢測(cè)血糖和尿蛋白，均為陰性者用于實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為正常組和造模組，其

5、申正常組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，造模組給予高脂飼料。高脂飼料喂養(yǎng)十二周后，造模組大鼠一次性腹腔注射STZ30mg·kg-1，72h后測(cè)血糖，三次連續(xù)隨機(jī)尾靜脈血糖≥16.7mmol·-1為DM模型成功，并繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)。造模組大鼠隨機(jī)分為模型組、厄貝沙坦組及中藥組。
　　厄貝沙坦組大鼠給予厄貝沙坦11.51mg·kg-1·d-1灌胃，中藥組大鼠給予中藥配方顆粒1.0g·kg-1·d-1灌胃，余組給予等劑量生理鹽水灌胃，每日給藥

6、一次，連續(xù)32周。于給藥第32周末，收集24h尿液，股動(dòng)脈采血，處死大鼠，分離腎臟皮髓質(zhì)，檢測(cè)各組大鼠24h尿蛋白定量，光鏡、電鏡下觀察各組大鼠腎臟的病理改變，并應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)各組大鼠腎皮質(zhì)Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)水平。
　　3益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病大鼠腎臟ROS介導(dǎo)JNK信號(hào)通路的影響
　　動(dòng)物模型的建立及給藥方法同上，于給藥第32周末，留取腎組織標(biāo)本，采用FCM方法檢測(cè)各組大鼠腎組織ROS水平；采用Western

7、-blot及FCM方法檢測(cè)各組大鼠腎組織JNK、p-JNK蛋白的表達(dá)水平。
　　4益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的影響
　　動(dòng)物模型的建立及給藥方法同上，于給藥第32周末，留取腎組織標(biāo)本，采用FCM方法檢測(cè)各組大鼠腎臟細(xì)胞凋亡率；采用RT-PCR及IHC方法檢測(cè)檢測(cè)各組大鼠腎組織Caspase-3 mRNA和蛋白的表達(dá)水平；采用Western-blot及FCM方法檢測(cè)各組大鼠腎組織Caspase-3、Activ

8、edcaspase-3蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥治療早期糖尿病腎病的臨床研究
　　1.1兩組總體療效比較
　　治療組37例，顯效18例，有效13例，無(wú)效6例，總有效率達(dá)83.8％；對(duì)照組38例，顯效10例，有效13例，無(wú)效15例，總有效率達(dá)60.5％。兩組相比較，治療組療效明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.131，P＜0.05)。
　　1.2中醫(yī)證候積分比較
　

9、　兩組治療前比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；治療組治療前后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)；對(duì)照組治療前后神疲乏力、腰脊酸痛癥狀改善明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其余癥狀無(wú)明顯改善；兩組治療后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)。
　　1.3治療前后尿白蛋白排泄率、血肌酐、尿素氮、血脂比較
　　兩組治療前比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；兩組治療后尿白蛋白排泄率、血肌酐、尿素氮

10、、血脂均較治療前顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)；兩組各項(xiàng)治療后比較，治療組血脂較對(duì)照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而尿白蛋白排泄率、血肌酐、尿素氮兩組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　1.4終點(diǎn)事件發(fā)生率比較
　　治療組終點(diǎn)事件發(fā)生率為5.4％，對(duì)照組為10.5％，兩者相比較，治療組要低于對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病大鼠腎

11、臟的保護(hù)作用
　　2.1各組大鼠24h尿蛋白定量(U Pro)的比較
　　與正常組比較，模型組與兩治療組U Pro均有升高(P＜0.01)：與模型組比較，兩治療組U Pro均有下降(P＜0.01)，兩治療組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.2各組大鼠腎臟病理形態(tài)學(xué)觀察
　　光鏡觀察：正常組大鼠腎臟腎小球結(jié)構(gòu)清晰完整，未見(jiàn)明顯肥大及萎縮，基底膜無(wú)增厚，系膜無(wú)增生。模型組大鼠腎臟腎小球明顯肥大，腎小囊腔呈裂

12、隙狀，基底膜明顯增厚，系膜增生，系膜區(qū)增寬，部分腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞排列紊亂、肥大、空泡樣變性。與模型組比較，厄貝沙坦及中藥組病理改變也有所改善，但兩治療組間差異不明顯。
　　電鏡觀察：正常組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小球毛細(xì)血管基底膜均勻無(wú)增厚，上皮足突分布均勻。模型組腎小球毛細(xì)血管基底膜高度勻質(zhì)樣增厚；足細(xì)胞足突廣泛融合；內(nèi)皮細(xì)胞高度融合，窗口大部分消失。與模型組比較，兩治療組病理改變也有所改善，但兩治療組間差異不明顯。
　　

13、2.3腎皮質(zhì)Col-Ⅰ mRNA表達(dá)比較
　　與正常組比較，模型組及兩治療組Col-Ⅰ mRNA表達(dá)均明顯增加(P＜0.01)。與模型組比較，兩治療組Col-Ⅰ mRNA表達(dá)均明顯減少(P＜0.05，P＜0.01)，兩治療組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病大鼠腎臟ROS介導(dǎo)JNK信號(hào)通路的影響
　　3.1流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)腎組織中ROS水平
　　與正常組比較，模型組及兩治療組

14、ROS水平均增加(P＜0.01)。與模型組比較，兩治療組ROS水平均減少(P＜0.01)，兩治療組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.2 Western-blot及流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)腎組織中JNK、p-JNK蛋白的表達(dá)
　　與正常組比較，模型組及兩治療組JNK、p-JNK.蛋白表達(dá)量均增加(P＜0.01)。與模型組比較，兩治療組JNK、p-JNK蛋白表達(dá)量均減少(P＜0.05，P＜0.01)，兩治療組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

15、(P＞0.05)。
　　4益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞凋亡的影響
　　4.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腎組織細(xì)胞凋亡率
　　與正常組比較，模型組及兩治療組細(xì)胞凋亡率均增加(P＜0.01)。與模型組比較，兩治療組細(xì)胞凋亡率均減少(P＜0.01)，兩治療組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.2 RT-PCR及免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腎組織中Caspase-3 mRNA和蛋白的
　　表達(dá)
　　與正常組比

16、較，模型組及兩治療組Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均增加(P＜0.01)。與模型組比較，兩治療組Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均減少(P＜0.01)，兩治療組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　4.3 Western-blot及流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)腎組織Caspase-3、Activedcaspase-3蛋白的表達(dá)
　　與正常組比較，模型組及兩治療組Caspase-3、Actived caspase

17、-3蛋白表達(dá)量均增加(P＜0.01)。與模型組比較，兩治療組Caspase-3、Activedcaspase-3蛋白表達(dá)量均減少(P＜0.01)，兩治療組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥能明顯改善早期DN患者的癥狀、體征，并且總體療效和中醫(yī)證候療效均優(yōu)于厄貝沙坦。
　　2.益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥能明顯調(diào)節(jié)脂代謝紊亂，降低早期DN患者尿白蛋白排泄率、血肌酐、尿素氮，保護(hù)腎功能，從

18、而延緩DN的進(jìn)展。但由于隨訪(fǎng)時(shí)間和樣本量的局限，其療效還有待于長(zhǎng)期預(yù)后研究的進(jìn)一步證實(shí)。
　　3.益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥可改善DN大鼠一般狀況，減少尿蛋白排泄，減輕腎臟病理?yè)p害，并下調(diào)Col-Ⅰ表達(dá)，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)積聚，進(jìn)而延緩腎小球硬化的發(fā)生發(fā)展。
　　4.益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥能減少DN大鼠腎臟細(xì)胞凋亡數(shù)量，抑制糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制JNK信號(hào)通路的活化，從而下調(diào)Caspase-3和Actived caspas