mTORC2-Rictor調(diào)控非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤之一，在我國肺癌的發(fā)病率和死亡人數(shù)位于惡性腫瘤的第一位。目前的研究認(rèn)為轉(zhuǎn)移的發(fā)生是導(dǎo)致臨床腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因，而癌細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在腫瘤轉(zhuǎn)移過程起非常重要的作用，因此明確調(diào)控癌細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)和EMT發(fā)生的詳細(xì)分子機(jī)制對(duì)于研究腫瘤轉(zhuǎn)移具有非常重要的意義，同時(shí)可以為臨床轉(zhuǎn)移腫瘤的診斷和治療提供新的潛在靶點(diǎn)。
　　 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)成雷帕霉素

2、不敏感的蛋白激酶復(fù)合體mTORC2的關(guān)鍵分子Rictor在多種癌組織中高表達(dá)，而且與患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，目前對(duì)mTORC2/Rictor在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的詳細(xì)作用機(jī)制并不清楚。在本次研究中我們擬采用小RNA干擾等一系列分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)、并結(jié)合EGF誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)和TGFβ誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞EMT發(fā)生模型，分析探討mTORC2/Rictor在調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移能力中的作用機(jī)制，最后在免疫缺陷小鼠轉(zhuǎn)移模型中驗(yàn)證Ric

3、tor表達(dá)下調(diào)對(duì)肺癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　 方法:
　　 1)采用基于慢病毒的小RNA干擾技術(shù)下調(diào)Rictor在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，研究其表達(dá)下調(diào)對(duì)EGF誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)能力的影響;
　　 2)采用傷口愈合實(shí)驗(yàn)分析Rictor表達(dá)下調(diào)對(duì)劃痕誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞極化和定向遷移能力的影響;采用粘附實(shí)驗(yàn)觀察肺癌細(xì)胞中Rictor表達(dá)下調(diào)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)粘附能力的影響;分析Rictor表達(dá)下調(diào)對(duì)EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架

4、蛋白F-actin聚合能力的影響;
　　 3)采用Westemblotting的方法研究Rictor表達(dá)下調(diào)對(duì)EGF誘導(dǎo)的下游信號(hào)分子激活的影響;
　　 4)采用免疫熒光染色和Western blotting的方法研究Rictor表達(dá)下調(diào)對(duì)TG耶誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞EMT發(fā)生的影響;
　　 5)采用免疫熒光染色和Western blotting的方法分析Rictor表達(dá)下調(diào)對(duì)TGFβ誘導(dǎo)的經(jīng)典Smads通路和非經(jīng)典Sm

5、ads通路中mTORC2/Akt、Erk1/2和 GSK3β/β-catenin信號(hào)通路激活的影響;
　　 6)采用免疫熒光染色和Western blotting的方法研究抑制GSK3β活性對(duì)TGFβ誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞EMT發(fā)生的影響;
　　 7)采用免疫熒光染色和Western blotting的方法分析下調(diào)β-catenin的表達(dá)對(duì)TGFβ誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞EMT發(fā)生的影響;
　　 8)采用免疫組織化學(xué)的方法分析Ri

6、ctor在肺癌組織中的表達(dá)情況;
　　 9)在免疫缺陷小鼠轉(zhuǎn)移模型中研究下調(diào)Rictor的表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響;
　　 結(jié)果:
　　 1)下調(diào)Rictor的表達(dá)明顯抑制了EGF誘導(dǎo)的蛋白激酶Akt的磷酸化，同時(shí)抑制了EGF誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)能力和劃痕誘導(dǎo)細(xì)胞極性的重新建立和定向遷移能力;而且Rictor降表達(dá)的細(xì)胞對(duì)Fibronectin的粘附能力明顯降低，對(duì)EGF誘導(dǎo)的F-actin聚合能力也明顯

7、下降;
　　 2)下調(diào)肺癌細(xì)胞A549中Rictor的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞中上皮標(biāo)志性蛋白E-cadheirn表達(dá)升高和間質(zhì)標(biāo)志性蛋白Vimentin的表達(dá)下降即細(xì)胞發(fā)生類MET變化;
　　 3)下調(diào)Rictor的表達(dá)明顯抑制了TGFβ誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌A549和H358細(xì)胞EMT的發(fā)生;
　　 4)下調(diào)Rictor的表達(dá)對(duì)TGFβ誘導(dǎo)的經(jīng)典Smads通路以及Erk1/2的激活沒有明顯影響，但是抑制了TGFβ誘導(dǎo)的Akt

8、473位點(diǎn)的磷酸化和GSK3β的磷酸化，同時(shí)抑制了TGFβ誘導(dǎo)的β-catenin向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位;
　　 5)采用GSK3β的抑制劑LiC1抑制Rictor表達(dá)下降細(xì)胞中GSK3β的活性可以恢復(fù)TGFβ誘導(dǎo)的EMT的發(fā)生;
　　 6)下調(diào)β-catenin的表達(dá)可以明顯抑制TGFβ誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，但是對(duì)TGFβ誘導(dǎo)的經(jīng)典Smads通路和非經(jīng)典Smads通路沒有明顯影響;
　　 7)免疫組化的結(jié)果顯示Ric

9、tor在肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，而且Rictor表達(dá)上調(diào)與患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，但是與患者的年齡、性別、TNM分期和淋巴結(jié)狀態(tài)沒有明顯相關(guān)性;
　　 8)免疫缺陷小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型顯示下調(diào)Rictor的表達(dá)明顯抑制了肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。
　　 結(jié)論:
　　 下調(diào)Rictor的表達(dá)可以明顯抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞在體外的遷移能力和免疫缺陷小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力，表明Rictor是調(diào)節(jié)癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移能力的一個(gè)非常關(guān)鍵的因子。進(jìn)一

10、步的研究發(fā)現(xiàn)Rictor主要通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)和腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化兩個(gè)方面從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。一方面，Rictor調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)主要通過與mTOR形成的蛋白激酶復(fù)合體mTORC2而實(shí)現(xiàn)，Rictor/mTORC2通過調(diào)節(jié)蛋白激酶Akt的活性繼而傳遞了EGF誘導(dǎo)的趨化運(yùn)動(dòng)信號(hào)通路。下調(diào)Rictor的表達(dá)抑制了劃痕誘導(dǎo)的癌細(xì)胞極性重新建立和定向遷移能力;癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力以及細(xì)胞遷移過程中細(xì)胞骨架蛋白F-acti

11、n的重構(gòu)能力從而抑制了細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)。另一方面下調(diào)Rictor的表達(dá)誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549發(fā)生類MET變化，說明mTORC2是維持間質(zhì)細(xì)胞表型所必須的。機(jī)理方面的研究發(fā)現(xiàn)mTORC2/Rictor介導(dǎo)TGFβ誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞EMT發(fā)生主要通過交叉激活Wnt通路中的GSK3β/β-catenin信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)EMT發(fā)生相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)。我們的研究結(jié)果提示Rictor/mTORC2調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的EMT和趨化運(yùn)動(dòng)兩者之間是相互促進(jìn)和相互協(xié)作的