慢性萎縮性胃炎模型大鼠定量蛋白組學及中藥干預靶點研究.pdf

1、背景及目的
　　慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是慢性胃炎的亞型之一。胃黏膜萎縮，腸上皮化生(intestinal metaplasia，IM)及伴發(fā)的異型增生(Dysplasia，Dys)，與胃癌發(fā)病密切相關。CAG是最常見的胃癌前疾病。CAG發(fā)病率及檢出率隨年齡增長而增加，已經(jīng)嚴重威脅著我國人民的身體健康。目前，對于CAG的發(fā)病原因、發(fā)病機制尚不明確，亦無有效藥物治療。本病因為病情

2、進展緩慢、診斷及療效評價需行胃鏡及病理活檢有創(chuàng)檢查，病變常常灶性分布，而且患者多為中老年人，往往合并其他慢性病，病情復雜，使得針對本病的臨床試驗較難開展。復制本病動物疾病模型以大大縮短病程，去除不必要因素對于疾病影響，尤其規(guī)避倫理問題，可有力地推動本病的病因?qū)W、發(fā)病學以及防治方法的研究。由于CAG病因復雜，西醫(yī)學對CAG尚缺乏理想的治療措施，而中醫(yī)藥辨證治療療效甚佳，不但能緩解癥狀，在延緩病理進展甚至逆轉(zhuǎn)病變方面有一定優(yōu)勢。隨著對CAG

3、認識的不斷深入和現(xiàn)代分子生物技術的發(fā)展，中醫(yī)藥治療CAG的機制研究也得到了深入和發(fā)展。CAG動物模型是深入研究發(fā)生機制和評價相關藥物效果的必不可少的工具。目前CAG大鼠模型造模方法眾多，缺乏客觀評價。針對以上問題，本文展開如下研究:對比兩種不同慢性萎縮性胃炎大鼠復合造模法，通過成模時間、模型成功率、大鼠死亡率、血清胃蛋白酶原檢測、病理組織學觀察等方面確定穩(wěn)定造模方法;利用TMT定量蛋白組學技術鑒定慢性萎縮性胃炎模型大鼠與正常大鼠胃黏膜的

4、差異蛋白，采用高通量組學數(shù)據(jù)分析，闡釋本病發(fā)病的生物學基本分子機制，結合蛋白富集分析及節(jié)點蛋白連接度分析篩選靶點蛋白，利用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)及實時熒光聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測靶點蛋白在CAG模型大鼠胃黏膜中異常表達，從而驗證蛋白組學結果;選用以半夏瀉心湯加減，立法于辛開苦降、益氣活血的中藥協(xié)定方為干預藥物，探索中藥對CAG的治療作用，初步篩選中藥作用靶點。動物實驗分為以下三部分。
　　1.慢性萎縮性胃炎動物模型的

5、探索
　　材料與方法
　　實驗動物SPF級4周齡健康雄性SD大鼠60只。按體重隨機分為3組。正常組大鼠8只;N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(N-Methyl-N-nitroso-N'-nitroguanidine，MNNG)復合高鹽熱淀粉糊造模法組(M1組)26只SD大鼠;MNNG復合酒精綜合造模法（M2組）26只SD大鼠。正常組大鼠予SPF級正常水料飼養(yǎng)，每天灌胃1次5ml生理鹽水。M1組予0.03％雷尼替丁飼料喂養(yǎng)，

6、自由飲用2％水楊酸鈉溶液，每日灌胃120μg/mLMNNG次，每周禁食1次，每次18小時，自第14周起禁食第2天灌胃高鹽熱淀粉糊，當天不再灌胃MNNG溶液。M2組大鼠予0.03％雷尼替丁飼料喂養(yǎng)，每日自由飲用2％水楊酸鈉溶液，每日灌胃120μg/mL MNNG1次，每周禁食1次，每次18小時，自第14周起禁食第2天灌胃35％酒精，當天不再灌胃MNNG溶液，連續(xù)造模至18周，M1、M2組大鼠每2周隨機處死2只，取胃觀察胃黏膜病理改變。通過

7、成模時間、模型成功率、大鼠死亡率、血清胃蛋白酶原檢測、病理組織學觀察等方面確定穩(wěn)定造模方法。
　　結果
　　MNNG復合酒精灌胃造模方法及MNNG復合高鹽熱淀粉糊造模方法均可較好復制CAG病變過程;兩組大鼠胃黏膜病理積分、血清胃蛋白酶原水平無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);兩組大鼠肝細胞H&E染色病理切片觀察均發(fā)現(xiàn)空泡變性，為早期肝臟損傷表現(xiàn)，考慮與MNNG在肝臟中代謝相關;MNNG復合酒精灌胃造模方法動物死亡率較低，并發(fā)癥較少

8、，可用于后續(xù)萎縮性胃炎動物試驗的應用研究。
　　2.慢性萎縮性胃炎模型大鼠定量蛋白組學研究
　　材料與方法
　　利用TMT(Tandem Mass Tags)定量蛋白組學技術篩選MNNG復合酒精灌胃CAG模型大鼠胃竇黏膜組織（制備方法同實驗1）與正常大鼠胃竇黏膜組織的差異蛋白，采用高通量組學數(shù)據(jù)分析闡釋慢性萎縮性胃炎胃黏膜發(fā)生的生物學基本分子機制。并結合蛋白功能富集分析結果、信息通路富集結果、蛋白互作網(wǎng)絡分析、節(jié)點蛋白

9、連接度分析，篩選關鍵靶點蛋白。
　　結果
　　(1)通過TMT定量蛋白組學鑒定CAG大鼠胃竇黏膜組織與正常大鼠胃竇黏膜組織的差異表達蛋白共鑒定6937個蛋白，有統(tǒng)計學意義差異蛋白363個，采用GO分析軟件David生物信息學軟件(http://david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsp)分別從分子功能、亞細胞定位和生物學途徑、信號轉(zhuǎn)導通路方面對差異蛋白進行功能注釋。分子功能富集顯示差異蛋白主要為bi

10、nding蛋白，亞細胞定位在細胞質(zhì)、細胞外的外來體、細胞外空間、線粒體、胞質(zhì)、粘著斑、細胞質(zhì)細胞核周圍的地區(qū)等區(qū)域，生物學途徑主要參與應對藥物、應對乙醇、應對饑餓，其他在蛋白質(zhì)水解、缺氧、補體經(jīng)典反應、細胞粘附等生物過程起到作用。涉及粘著斑通路、MAPK信號通路、阿米巴病、病毒致癌、緊密連接、腫瘤的蛋白聚糖、補體系統(tǒng)、蛋白質(zhì)消化吸收等多條信號轉(zhuǎn)導通路，經(jīng)STRING網(wǎng)軟件分析表明差異蛋白互作網(wǎng)絡復雜。
　　(2)并將互作網(wǎng)絡數(shù)據(jù)導

11、出到Cytoscape3.2軟件中，根據(jù)節(jié)點蛋白連接度分析，判斷網(wǎng)絡中心節(jié)點蛋白。綜合KEGG數(shù)據(jù)庫的信號通路分類、功能注釋等，篩選出關鍵蛋白選取FLNa、TGFR-β1、Bad蛋白，以ELISA、RT-PCR方法驗證本次蛋白組學實驗結果（見實驗3）。
　　(3)通過對差異蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)具有促凋亡作用的Casp3降低，而Bcl-2家族促凋亡因子Bad上調(diào)。Caspase家族處于Bcl-2家族下游。Bad的促凋亡作用依賴于與Bcl

12、-2結合，蛋白組學結果并未顯示Bcl-2表達異常。為了探究Bad表達的上調(diào)對Bcl-2家族調(diào)控的凋亡的影響，采用RT-PCR方法鑒定CAG模型大鼠與正常大鼠胃竇黏膜中Bcl-2 mRNA表達（見實驗3）。
　　3.差異蛋白的驗證及中藥干預慢性萎縮性胃炎大鼠作用靶點研究
　　材料與方法
　　100只SPF級SD大鼠根據(jù)體重隨機分為兩組?？瞻捉M（N組）10只，給以SPF級動物標準飲食喂養(yǎng)，每日灌胃生理鹽水1次，持續(xù)至實驗結

13、束。造模組90只，按上述方法進行CAG造模，于實驗第18，20，22，24，26周末各隨機抽檢2只處死，取胃黏膜觀察病理改變。造模成功后，將剩余大鼠按體重隨機分成4組，模型組（M組），模型對照組（C組），慢性萎縮性胃炎協(xié)定方高劑量組（G組）、慢性萎縮性胃炎協(xié)定方低劑量組（D組）。成模后N組、M組大鼠即刻處死。其余大鼠均給予SPF級動物標準飲食喂養(yǎng)。C組予生理鹽水3mL/kg灌胃，每日1次;G組、D組分別予慢性萎縮性胃炎協(xié)定方配方顆粒劑制

14、備藥液5ml，分別相當于顆粒劑3g/kg/d、1.5g/kg/d(相當于生草藥21.9g/kg/d、11g/kg/d)灌胃，每日1次。治療階段持續(xù)8周，治療結束后處死大鼠。觀察大鼠胃黏膜病理改變，評價中藥協(xié)定方治療CAG的療效。利用ELISA法測定N組、M組胃竇黏膜TGF-β1、FLNa、Bad蛋白表達水平，RT-PCR法測定N組、M組、G組、D組胃竇黏膜TGF-β1、FLNa、Bad、Bcl-2的mRNA水平。
　　結果

15、　　(1)中藥協(xié)定方可顯著改善CAG模型大鼠胃竇黏膜萎縮（P＜0.05）、異型增生（P＜0.05），腸上皮化生積分較模型組大鼠有所下降，但未見明顯統(tǒng)計學差異。
　　(2) ELISA法測定TGF-β1、FLNa、Bad蛋白在M組、C組大鼠胃黏膜表達較N組上調(diào)(P＜0.05); RT-PCR法測定M組、C組大鼠胃黏膜TGF-β1mRNA、FLNa mRNA、Bad mRNA表達較N組上調(diào)（P＜0.05）。M組、C組大鼠與N組大鼠Bc

16、l-2的mRNA表達水平無明顯差異，與蛋白組學結果一致?？紤]CAG模型大鼠胃黏膜中異常上調(diào)的Bad蛋白可能無活性，未能引起下游Bcl-2家族的表達改變。
　　(3) RT-PCR測定中藥組TGF-β1、FLNa、Bad的mRNA表達量較M組、C組水平下調(diào)（P＜0.05）。
　　結論
　　(1)本研究參照相關文獻并加以改進，對比MNNG溶液復合酒精灌胃及MNNG復合高熱淀粉糊灌胃，綜合對比成模時間、死亡率、病理轉(zhuǎn)化率、肝

17、臟病理改變等確定MNNG溶液復合酒精灌胃模型該模型操作簡單易行，且穩(wěn)定性較好，但仍有耗時較長的不足，有待于今后進一步改進。
　　(2)采用高通量蛋白組學法篩選MNNG溶液復合酒精灌胃模型大鼠與正常大鼠胃竇黏膜間差異蛋白，通過GO分析及Pathway分析可說明，CAG胃黏膜病變涉及多項、復雜生物途徑，影響粘著斑、MAPK、緊密連接、蛋白聚糖改變、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)等多條通路。根據(jù)節(jié)點蛋白連接度分析篩選出FLNa、Bad、及TGF-β