豬鏈球菌2型免疫蛋白組學和比較蛋白組學研究.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis)是一種革蘭氏陽性菌,有35個血清型,其中SS2致病力最強,可引致豬的急性敗血癥及相關人員感染而死亡,造成較大的經(jīng)濟損失,產生重大的社會影響,成為公共衛(wèi)生突發(fā)事件,倍受世人關注。 為了進一步了解SS2免疫及致病機制,本文使用蛋白組學的方法對其進行研究,以期發(fā)現(xiàn)新的免疫原性蛋白及尋找新毒力標志物。 為了高通量地篩選亞單位疫苗的候選物,本試驗采用了免疫蛋白組學的方法,對SS2的可

2、刺激宿主產生抗體的分泌蛋白(extracellular proteins)、膜相關蛋白(membrane-associated proteins,MAP)和細胞壁蛋白(cell-wall proteins,CWP)分別進行了篩選。 應用免疫蛋白組學方法,分析SS2的分泌蛋白,以SPF微型豬SS2康復血清為一抗,HRP-SPA為二抗,對轉移到PVDF膜的中國分離株ZY05719及HA9801的上清蛋白,檢測具有免疫原性的蛋白。將重

3、復膠上與之對應的蛋白點進行MALDI-TOF-MS分析。共鑒定出7個免疫原性蛋白,其中包括溶菌酶釋放蛋白(muramidase-released protein,MRP)、胞外因子(extracellurlar factors,EF)和溶血素(suilysin,SLY),同時還發(fā)現(xiàn)4個以前未被報道的免疫原性蛋白。 用Triton X-114法富集SS2 HA9801的膜相關蛋白。作免疫蛋白組學分析,以SPF微型豬SS2免疫血清為

4、一抗,HRP標記的羊抗豬為為二抗,對轉移到PVDF膜上的HA9801膜相關蛋白進行檢測。總共發(fā)現(xiàn)13個免疫原性的蛋白,將重復膠上相應的點進行MALDI-TOF-MS檢測,全部成功地被鑒定出來,其中7個為首次報道。 用變溶菌素法提取SS2 HA9801的細胞壁蛋白.應用免疫蛋白組法,以SPF微型豬的免疫血清為一抗,HRP標記的羊抗豬為二抗,對轉印到PDVF膜上的CWP蛋白進行檢測,并將重復膠上相應的點進行MALDI-TOP-MS檢

5、測。共有有11蛋白點個被檢出有免疫原性,用質譜鑒定屬于7種蛋白,其中4種為首次報道。自然界中存在的SS2包括有強毒株和無毒株。本試驗采用比較蛋白組學的方法,比較了SS2兩株強毒株(HA9801和ZY05719)與無毒株T15蛋白二維表達圖譜,以期確認和發(fā)現(xiàn)SS2毒力標志物。 在對強毒株(HA9801和ZY05719)與弱毒株(T15)之間的分泌蛋白的二維電泳圖譜比較中,一共發(fā)現(xiàn)了九個差異點,其中的八個被生物質譜成功鑒定,其中包括

6、包括MRP、EF、SLY。根據(jù)差異蛋白的基因合成引物,以三株SS2菌株DNA為模板進行擴增,其中有5對引物在三株細菌中均擴增出相應基因,一對引物均未擴出,二對僅在強毒株中擴增出。 同樣采用比較蛋白組學的方法,比較HA9801和ZY05719與T15菌體蛋白的二維表達圖譜。在強毒株與弱毒株之間,一共鑒定出3個差異點。根據(jù)差異蛋白的基因合成引物,以三株SS2菌株DNA為模板進行擴增,PCR結果表明,此三種蛋白的基因僅在強毒株中分布。