O1型擬南芥硫氧還蛋白基因在逆境脅迫下的功能解析.pdf

1、當(dāng)前，在世界范圍內(nèi)，土壤鹽漬化及次生鹽漬化現(xiàn)象日趨加重，成為主要的環(huán)境問題之一。在鹽脅迫下，植物生長緩慢，代謝受抑制，嚴(yán)重時出現(xiàn)鹽斑、葉片萎蔫，甚至死亡。近年來，隨著生物工程的興起，利用生物措施改良鹽堿地成為改良效果持久、穩(wěn)定且有利于水土保持和生態(tài)平衡的措施。因此，研究植物對于脅迫的應(yīng)答機(jī)制，發(fā)現(xiàn)相關(guān)抗性基因，培育耐逆品種在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義。
　　硫氧還蛋白(Trx)是一種低分子量(12kD)、熱穩(wěn)定、酸性蛋白，有高度保守

2、的活性位點WCG/PPC。它們在多種反應(yīng)中通過可逆的雙硫鍵和硫醇變化起氧化還原載體的作用，是重要的酶活力調(diào)節(jié)蛋白。它們的功能對細(xì)胞來說卻是至關(guān)重要的，如緩解胞內(nèi)氧化脅迫、控制生長、細(xì)胞程序死亡、細(xì)胞因子和趨化因子的活力。自發(fā)現(xiàn)硫氧還蛋白以來的幾十年里，人們對它的種類、特點、功能等方面有了越來越多的認(rèn)識，為更好地利用它奠定了必要的基礎(chǔ)。
　　本研究中，通過RT-PCR技術(shù)克隆了擬南芥硫氧還蛋白基因AtTrx o1，并對其進(jìn)行了的研究

3、。
　　我們把AtTrx o1型基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pQE-30中。質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株E.Coli M15。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，Ni+凝膠親和層析獲得了His-AtTrx o1融合蛋白，但不能夠達(dá)到后期研究的純度。我們做了純化條件的摸索，并沒有很好的解決這個問題，在以后的研究中，還要繼續(xù)摸索純化條件，以便進(jìn)行更加深入的對硫氧還蛋白生理生化方面的研究。
　　為了研究硫氧還蛋白基因表達(dá)與環(huán)境應(yīng)答之間的關(guān)系，通過North

4、ern雜交分析了在NaCl，NaHCO3，ABA和H2O2四種不同程度脅迫下，擬南芥懸浮細(xì)胞中Trx o1基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況。Northern雜交結(jié)果表明:Trx o1基因與環(huán)境脅迫都有一定的應(yīng)答關(guān)系，對不同的逆境處理變化趨勢不同。
　　最后將AtTrx o1基因構(gòu)建到雙元表達(dá)載體pBI121中，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將基因轉(zhuǎn)入模型植物擬南芥中。獲得了能夠穩(wěn)定遺傳并且沒有受到共抑制的4個轉(zhuǎn)基因株系。對轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行抗鹽性試驗，結(jié)果

5、表明轉(zhuǎn)AtTrx o1型基因擬南芥都比野生型有更好的生長勢。通過分析轉(zhuǎn)AtTrx o1型基因擬南芥在不同濃度NaCl逆境下的發(fā)芽情況，發(fā)現(xiàn)野生型擬南芥受到嚴(yán)重抑制，而轉(zhuǎn)基因擬南芥所受影響較小。通過統(tǒng)計根長變化，發(fā)現(xiàn)在50mM NaCl逆境下，轉(zhuǎn)AtTrx o1型基因擬南芥根伸長量分別比野生型增長了32.5％;在100mM NaCl逆境下，轉(zhuǎn)AtTrx o1型基因擬南芥根伸長量分別比野生型增長了62.5％;在125mM NaCl下增長了5

6、3％;在200mM NaCl下，野生型擬南芥不能正常發(fā)芽，而轉(zhuǎn)AtTrxo1型基因擬南芥能正常發(fā)芽，但生長受到抑制。為了進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽逆境的耐受關(guān)系，我們做了移栽試驗，研究表明在100mM NaCl鹽脅迫下，野生型植物生長受到嚴(yán)重影響，葉片顯得萎縮，而轉(zhuǎn)AtTrx o1型基因擬南芥受到的抑制很小，能夠正常生長。
　　以上研究表明，O1型擬南芥硫氧還蛋白基因在植物抵抗外界非生物逆境中起著重要作用，能夠提高植物對鹽逆境的耐