稻瘟菌激活蛋白基因克隆及功能解析.pdf

1、本研究以稻瘟菌為實驗材料，首次建立了從稻瘟病菌中分離激活蛋白的技術(shù)路線和方法，并對激活蛋白進(jìn)行了多項生物功能測定；利用抑制性消減雜交技術(shù)成功構(gòu)建了植物激活蛋白處理水稻與非處理組水稻中差異表達(dá)的消減cDNA文庫；克隆了稻瘟菌激活蛋白基因，首次獲得了穩(wěn)定表達(dá)可溶性稻瘟菌激活蛋白的菌株，并確定了表達(dá)蛋白的活性，該研究為確定激活蛋白的結(jié)構(gòu)與功能及理化性質(zhì)奠定基礎(chǔ)。 建立了分離純化激活蛋白的技術(shù)路線和方法。激活蛋白粗提液經(jīng)HitrapQF

2、F離子交換柱層析和HitrapSuperdex75分子篩層析純化，即可得到40KDa、pI為4.7、不含糖基的單一蛋白。質(zhì)譜測序結(jié)果共獲得12個肽段的氨基酸序列，檢索比對發(fā)現(xiàn)與GenBank中ID為EAA52615的推測蛋白具有100％的序列相似性，序列覆蓋率達(dá)50.7％。 通過一系列活性測定，確定稻瘟菌激活蛋白具有廣譜生物活性。用純化后的稻瘟菌激活蛋白處理植物可明顯提高絲瓜、番茄等發(fā)芽率；同時具有促進(jìn)植物幼苗生長的作用；還能增

3、強(qiáng)植物抗病性，對番茄灰霉病的防效達(dá)到44％，對水稻稻瘟菌的防效達(dá)到50.68％；另外，還能提高水稻的抗旱性，抗旱綜合指數(shù)從55提高到92。經(jīng)激活蛋白處理后，纖維素酶和醇脫氫酶活性增強(qiáng)，過氧化氫和脯氨酸的含量也明顯提高，這些酶和活性物質(zhì)與植物生長及抗逆方面有關(guān)。 構(gòu)建了差異表達(dá)的消減cDNA文庫，并獲得28個上升表達(dá)差異基因。本研究通過雙向電泳和反相色譜發(fā)現(xiàn)激活蛋白處理水稻后，水稻幼葉中的部分蛋白表達(dá)發(fā)生明顯改變，其中部分親水性蛋

4、白表達(dá)量降低，而部分疏水性蛋白表達(dá)量增加。為探明這種變化，利用抑制性消減雜交技術(shù)(SuppressionSubtractiveHybridization，SSH)成功構(gòu)建了植物激活蛋白處理水稻與非處理組水稻中差異表達(dá)的消減cDNA文庫。從文庫中篩選到1756個克隆，通過反向Southern雜交，選取264個有效克隆并測序，利用BLAST在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列相似性比對分析，獲得28個上升表達(dá)差異基因，這些基因與植物的光合作用、營

5、養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸代謝等多種植物的生理生化功能相關(guān)。 從稻瘟菌中克隆了激活蛋白基因并在E.coli中表達(dá)，首次確定其促生長的生物功能。從稻瘟菌北1-24、CH353、CH363、CH369中分別擴(kuò)增獲得激活蛋白基因組DNA，它們之間的序列完全一致，但與GenBank數(shù)據(jù)庫中的稻瘟菌全基因序列有兩處不同：一處是在內(nèi)含子范圍內(nèi)的ACAC序列，另一處是在外顯子范圍內(nèi)的G堿基。通過反復(fù)測序，確定實驗獲得的稻瘟菌北1-24的序列是正確的。通過磁