黃芪甲苷對高胰島素致腎損傷的影響及機制研究.pdf

1、第一部分：黃芪對高胰島素血癥致早期2型糖尿病患者腎損傷的影響
　　目的：評價黃芪（astragalus）對高胰島素血癥（hyperinsulinemia，HINS）致早期2型糖尿病患者腎損傷的影響。
　　方法：早期2型糖尿病患者68例，采用多次皮下注射胰島素（Multiple subcutaneous insulin injection，MDI)的方式，給予強化血糖治療。強化治療的標準為空腹血糖（FPG）<7.0 mmoL/

2、L，餐后兩小時血糖（2 hPG）<10.0 mmoL/L。所有患者血糖達標后，繼續(xù)強化治療3周，查患者空腹胰島素（fasting insulin, FINS）水平≥15mU/L，即符合高胰島素血癥的診斷。將這些達到診斷標準的患者隨機分成兩組，即黃芪顆粒組（AG組）和高胰島素血癥組（HINS組），每組20例，于分組后次日清晨（黃芪顆粒干預前，T0時間點）抽血檢查空腹血糖(FPG)、餐后兩小時血糖（2hPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、丙

3、氨酸氨基轉移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、血肌酐（CREA）、血尿素氮（BUN）、視黃醇結合蛋白（RBP）、胱抑素C（Cys-C）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）。留晨尿檢測尿微量白蛋白（Ualb）。AG組患者在每天胰島素強化治療的基礎上，服用黃芪顆粒，用法是每次4g，每天兩次；HINS組患者繼續(xù)進行胰島素強化治療，不加任何其他藥物。兩組患

4、者均繼續(xù)強化治療9周。未達到高胰島素血癥診斷標準的28例患者可以自行選擇繼續(xù)治療的方式，不再列入實驗對象進行干預。AG組和HINS組于強化治療結束后（黃芪顆粒干預后，T1時間點）抽血復查T0時間點的所有指標。
　　結果：在T1時間點，與HINS組比較，AG組RBP、Cys-C、Ualb、MDA值均小于HINS組，而GSH-PX、SOD值均大于HINS組，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。兩組患者的FPG、2hPG在各自的組內，從T0

5、到T1，有升高趨勢，而HbA1c有下降趨勢（P<0.05）；在HINS組內，從T0到T1，RBP、Cys-C、Ualb、MDA有升高趨勢，而GSH-PX、SOD有下降趨勢（P<0.05）。
　　結論：對早期2型糖尿病患者使用胰島素進行強化治療，血糖達標后，繼續(xù)治療超過3周，患者可以出現(xiàn)高胰島素血癥，這種高胰島素血癥持續(xù)9周以上，可以對腎臟有輕微的損傷作用，具體表現(xiàn)在可以使得RBP、Cys-C、Ualb等指標升高；也使得體內氧化應激

6、水平增高，具體表現(xiàn)在MDA升高，GSH-PX、SOD降低。黃芪顆粒能夠阻止高胰島素血癥下的RBP、Cys-C、Ualb水平的升高，還能夠阻止高胰島素血癥下體內的氧化應激的增強，對腎臟有保護作用。
　　第二部分：黃芪甲苷對高胰島素血癥致實驗性糖尿病大鼠腎損傷的影響及機制研究
　　目的：在建立的高胰島素血癥的糖尿病大鼠模型上，研究AS-Ⅳ對高胰島素血癥誘導的腎臟損傷的影響，分析AS-Ⅳ保護腎臟作用的可能機制。
　　方法：成

7、功建立實驗性糖尿病大鼠模型（腹腔注射STZ55 mg/kg)，一周以后，采用皮下注射地特胰島素（6U/day）的方式控制血糖，一直持續(xù)4周。4周后測量大鼠清晨的胰島素水平，當INS>30μU/ml,認為高胰島素血癥大鼠模型成功建立。符合高胰島素血癥診斷的大鼠隨機被分成5組，即高胰島素血癥組（HINS）、AS-Ⅳ（2.5、5和10 mg/kg/day，ig）組和Tempol（60mg/kg/day, ig）組；正常組（Control）作為

8、空白對照。除了正常組外，所有的高胰島素血癥大鼠繼續(xù)維持胰島素治療12周。血糖每隔1、2或4周測量一次，在第12周周末，檢測HbA1c、血清INS、CREA、BUN、ALT、AST、TG和TC。采用代謝籠法，在第4周、8周、12周周末收集24h尿液，測量24h尿白蛋白排泄率。檢測腎臟上極組織的MDA、GSH-Px、SOD、IL-1β、TNF-α和COl-Ⅳ。使用HE、PAS染色觀察常規(guī)腎臟病理切片；使用透射電鏡觀察腎小球超微結構。使用We

9、stern blot的方法，檢測Nox4、pERK1/2和TRPC6的蛋白表達。
　　結果：
　　1.與正常組比較，HINS組大鼠尿蛋白排泄率較高，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。AS-Ⅳ可以在一定程度上減輕白蛋白尿的癥狀。
　　2.與正常組比較，HINS組MDA水平增加，GSH-Px和SOD水平降低，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。AS-Ⅳ可以明顯減少MDA，增加GSH-Px和SOD。
　　3.與正常組比較，HIN

10、S組IL-1β和TNF-α水平增加，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。AS-Ⅳ可以明顯減少IL-1β和TNF-α。
　　4.與正常組比較，HINS組 Col-Ⅳ和 LN水平增加，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。AS-Ⅳ可以明顯減少Col-Ⅳ和LN。
　　5.與正常組比較，HINS組出現(xiàn)輕度的腎小球系膜細胞增生，AS-Ⅳ可以阻止腎小球系膜細胞的增生。
　　6.與正常組比較，HINS組腎小球基底膜增厚，足突細胞有少量融合，AS-

11、Ⅳ可以阻止腎小球基底膜增厚以及足突細胞融合。
　　7.與正常組比較，HINS組Nox4蛋白，pERK1/2蛋白水平增加，TRPC6蛋白水平降低，有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。AS-Ⅳ可以明顯抑制Nox4和pERK1/2蛋白的表達，而增加TRPC6蛋白的表達。
　　結論：
　　1. STZ誘導的糖尿病大鼠經(jīng)過胰島素強化治療4周，可以出現(xiàn)高胰島素血癥，這種狀態(tài)持續(xù)12周可以對腎臟造成損傷。
　　2. AS-Ⅳ對高胰島

12、素血癥對大鼠腎臟的損傷具有保護作用，其可能與抑制氧化應激、促炎癥因子生成，下調Nox4和pERK1/2蛋白的表達，增加TRPC6蛋白的表達有關。
　　第三部分：高胰島素致人腎小球系膜細胞損傷的機制研究及黃芪甲苷的干預作用
　　目的：
　　研究NADPH氧化酶/ROS/ERK信號通路在高胰島素致MCs損傷中的作用，探討黃芪甲苷對此通路的干預調控及對高胰島素致MCs損傷的影響。
　　方法：
　　1.將常規(guī)培養(yǎng)的

13、MCs細胞分為以下6組：NG（5.6 mM葡萄糖）組，胰島素（12.5、25、50、100、200 nM）組。將MCs分別孵育12h、24h、36h、48h、72h后，使用MTT的方法，檢測各組細胞的增殖情況。
　　2.將常規(guī)培養(yǎng)的MCs分為以下5組：（1）NG，（2）HINS（100nM）12h，（3） HINS（100nM）24h，（4）HINS（100nM）36h，（5）HINS（100nM）48h。采用實時熒光定量PCR法

14、檢測Nox4 mRNA和TRPC6 mRNA的表達；采用Western blot法檢測Nox4蛋白和TRPC6蛋白的表達。
　　3.將常規(guī)培養(yǎng)的MCs分為以下6組：（1）NG，（2）HINS（100nM）0.5h，（3） HINS（100nM）1h，（4）HINS（100nM）3h，（5）HINS（100nM）24h，（6） HINS（100nM）48h。分別給予高胰島素培養(yǎng)至相應時間，HINS分別刺激0.5h、1h、3h、24h

15、、48h，采用Western blot法檢測相應時間MCs中ERK1/2蛋白的磷酸化水平。
　　4.將常規(guī)培養(yǎng)的MCs細胞分為以下7組：（1）NG組，（2）NG+DPI（10μM）組，（3）NG+Tempol（100μM）組，（4）HINS（100nM）組，（5）HINS（100nM）+DPI（10μM）組，（6）HINS（100nM）+Tempol（100μM）組，（7）HINS（100nM）+U0126（10μM）組。分別給藥

16、48h后，采用MTT法對各組細胞的增殖情況進行檢測。
　　5.將常規(guī)培養(yǎng)的MCs細胞分為以下8組：（1）NG組，（2）NG+DPI（10μM）組，（3）NG+Tempol（100μM）組，（4）NG+U0126（10μM）組，（5）HINS（100nM）組，（6）HINS（100nM）+Tempol（100μM）組，（7）HINS（100nM）+DPI（10μM）組，（8）HINS（100nM）+U0126（10μM）組。分別給藥

17、48h后，采用DCFH-DA熒光探針法檢測各組細胞的ROS水平。
　　6.將常規(guī)培養(yǎng)的MCs分為以下5組：（1）NG組，（2）HINS（100nM）組，（3） HINS（100nM）+U012610μM組，（4）HINS（100nM）+DPI10μM組，（5） HINS（100nM）+Tempol100μM組。分別給藥48h后，采用光度法檢測各組細胞NADPH氧化酶活性，采用Western blot法檢測各組細胞的Nox4蛋白、T

18、RPC6蛋白的表達情況以及ERK1/2蛋白的磷酸化水平。
　　7.將常規(guī)培養(yǎng)的MCs細胞分為以下5組：（1）NG組，（2）HINS(100nM)組，（3）HINS(100nM)+AS-Ⅳ25μM組，（4）HINS(100nM)+AS-Ⅳ50μM組，（5）HINS(100nM)+AS-Ⅳ100μM組。48h后，采用MTT法分別檢測各組細胞的增殖情況。
　　8.將常規(guī)培養(yǎng)的MCs分為以下6組：（1）NG組，（2）HINS(100

19、nM)組，（3）HINS(100nM)+AS-Ⅳ25μM組，（4）HINS(100nM)+AS-Ⅳ50μM組，（5）HINS(100nM)+AS-Ⅳ100μM組，（6）HINS(100nM)+Tempol100μM組，分別給藥48h后，采用DCFH-DA熒光探針法檢測各組細胞ROS水平。
　　9.將常規(guī)培養(yǎng)的MCs分為以下6組：（1）NG組，（2）HINS(100nM)組，（3）HINS(100nM)+ AS-Ⅳ25μM組，（4）

20、HINS(100nM)+ AS-Ⅳ50μM組，（5） HINS(100nM)+AS-Ⅳ100μM組，（6）HINS(100nM)+OAG100μM組。給藥48h后，采用實時熒光定量PCR法進行檢測各組細胞的TRPC6 mRNA的表達水平，采用Western blot法進行檢測各組細胞的TRPC6蛋白的表達水平。
　　10.將常規(guī)培養(yǎng)的 MCs分為以下6組：（1）NG組，（2）HINS(100nM)組，（3） HINS(100nM)

21、+ AS-Ⅳ25μM組，（4）HINS(100nM)+ AS-Ⅳ50μM組，（5） HINS(100nM)+AS-Ⅳ100μM組，（6）HINS(100nM)+DPI10μM組。分別給藥48h后，采用光度法檢測各組細胞NADPH氧化酶活性，采用實時熒光定量PCR法檢測各組細胞的Nox4 mRNA的表達水平，采用Western blot法檢測各組細胞的Nox4蛋白的表達水平。
　　11.將常規(guī)培養(yǎng)的 MCs分為以下6組：（1）NG組

22、，（2）HINS(100nM)組，（3） HINS(100nM)+AS-Ⅳ25μM組，（4）HINS(100nM)+AS-Ⅳ50μM組，（5） HINS(100nM)+AS-Ⅳ100μM組，（6）HINS(100nM)+U012610μM組。給藥48h后，采用Western blot法檢測各組細胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平。
　　結果：
　　1.高濃度胰島素培養(yǎng)一定時間后，MCs的增殖顯著升高，并可促進ROS的生成。高胰島

23、素促進系膜細胞增殖的作用能夠被NADPH氧化酶抑制劑、ROS抑制劑和ERK通路抑制劑抑制。
　　2.高濃度胰島素培養(yǎng)一定時間后，MCs中Nox4 mRNA及蛋白表達水平顯著上調。使用特異性信號分子抑制劑后，高胰島素環(huán)境下MCs內Nox4蛋白和ROS的生成均顯著降低，提示高胰島素促系膜細胞增殖作用可能是通過上調 Nox4亞基的表達，從而促進ROS生成來實現(xiàn)的。
　　3.高濃度胰島素培養(yǎng)一定時間后，MCs中ERK1/2蛋白的磷酸

24、化水平顯著上調，激活ERK信號通路。NADPH氧化酶抑制劑和ROS抑制劑均能顯著抑制高胰島素環(huán)境下MCs中ERK1/2蛋白的磷酸化，提示高胰島素對MCs中ERK信號通路的調控作用與NADPH氧化酶性ROS具有密切的相關性。ERK通路被抑制時，對高胰島素環(huán)境下MCs中Nox4蛋白表達水平以及ROS水平均沒有明顯影響，僅能抑制細胞異常增殖。提示在上述信號通路中 ERK1/2活化處于NADPH氧化酶性ROS通路的下游。
　　4.高濃度胰

25、島素培養(yǎng)一定時間后，MCs中TRPC6 mRNA和蛋白表達水平顯著下調。當Nox4或pERK1/2表達被抑制時，高胰島素下調的TRPC6蛋白表達水平顯著升高；此外當采用NADPH氧化酶抑制劑、ROS抑制劑、ERK通路抑制劑時均能顯著增強高胰島素環(huán)境下MCs中TRPC6蛋白的表達，提示高胰島素可能是通過激活NADPH氧化酶/ROS/ERK信號通路來發(fā)揮對MCs中TRPC6蛋白表達的抑制作用。
　　5. AS-Ⅳ可以抑制高胰島素誘導的

26、 MCs異常增殖、Nox4亞基的表達上調、ROS生成、ERK1/2蛋白磷酸化以及TRPC6蛋白表達下調，從而發(fā)揮對系膜細胞中高胰島素環(huán)境下的NADPH氧化酶/ROS/ERK信號通路的抑制作用。
　　結論：
　　1.高濃度胰島素可以誘導MCs的異常增殖，并顯著抑制系膜細胞TRPC6蛋白的表達。高胰島素誘導系膜細胞損傷的作用可能是通過調節(jié) NADPH氧化酶/ROS/ERK信號通路來實現(xiàn)的，在該信號通路中，NADPH氧化酶性ROS