胰島素對高糖引起H9c2細胞損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　建立心肌細胞的高糖損傷模型；觀察高糖環(huán)境下胰島素對心肌細胞凋亡的影響及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子標志物的表達；觀察PI3K/AKT信號通路在高糖引起心肌細胞損傷中的作用。
　　方法：
　　1.心肌細胞培養(yǎng)和高糖損傷模型
　　大鼠心肌來源的H9c2細胞的常規(guī)培養(yǎng)使用5.5 mmol/L低糖DMEM,加入10％FBS。用35mmol/L高糖（HG，High Glucose）DMEM培養(yǎng)基孵育細胞不同時間（6h，1

2、2h，24h，48h，72h），建立心肌細胞高糖損傷模型。
　　2.細胞活力和凋亡檢測
　　將細胞分為對照組（低糖5.5 mmol/L）、高糖組（35 mmol/L）、胰島素組（INS,100nmol/L）、胰島素+高糖組。用MTT法檢測細胞活力，分別觀察0，24h，48h，72h和96h并記錄數(shù)據(jù)。根據(jù)細胞活力的數(shù)據(jù)分析選擇48h時間點做凋亡檢測，實驗分組同上，Hoechst染色檢測細胞凋亡。
　　3. RT-PCR

3、檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子標記物的表達
　　高糖處理H9c2細胞不同時間后，提取細胞總mRNA，檢測高糖對GRP78mRNA表達的時間效應(yīng)。根據(jù)時間效應(yīng)的結(jié)果，以48h為時間點，細胞分為4組：對照組(control)，高糖組(HG)，胰島素+高糖組，LY294002+胰島素+高糖組(LY294002預(yù)處理30min后，加入高糖和胰島素處理)，檢測各組GRP78mRNA的表達。LY294002是PI3K/AKT信號通路特異性的抑制劑。<

4、br>　　4. Westen-blot檢測蛋白表達
　　實驗分組：對照組(control)，高糖組(HG)，胰島素組，LY294002組，胰島素+高糖組，LY294002+胰島素+高糖組，48h后Western blot檢測各組細胞中t-Akt和p-Akt的蛋白表達水平。LY294002是PI3K/AKT信號通路特異性的抑制劑。
　　結(jié)果：
　　與對照組相比，高糖處理48h后，細胞活力下降（P<0.5）；與高糖組比較，

5、胰島素處理可以顯著提高細胞活力，細胞凋亡數(shù)也顯著減少；且48h時Hochest染色顯示，高糖組細胞核固縮，染色質(zhì)向外周聚集，或者細胞核碎裂成凋亡小體；RT-PCR結(jié)果提示高糖處理24h時，GRP78 mRNA水平表達被上調(diào)（P<0.01 vs. control）；與高糖組相比，胰島素+高糖組p-Akt蛋白的表達顯著增加(P<0.01)，且LY294002能明顯抑制胰島素引起的p-Akt的表達上調(diào)(P<0.01)。
　　結(jié)論：