黃芪甲苷對高糖誘導人腎小球系膜細胞損傷的保護作用及其機制研究.pdf

1、目的:
　　在體外,研究高糖誘導人腎小球系膜細胞(Human Mesangial Cell,HMC)損傷作用及黃芪甲苷(Astragalosides IV,As-IV)對其的保護作用,探討糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)發(fā)病機制與As-IV防治DN可能的作用機制,從而為As-IV的臨床應用提供更多的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.將HMC培養(yǎng)于含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中,置于5%

2、CO2,37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。
　　2.將常規(guī)培養(yǎng)的HMC隨機分為9組:正常糖組(NG,5.5 mmol/L葡萄糖);滲透壓對照組(NG+MA,5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇);高糖組(HG,30 mmol/L葡萄糖);Tempol組(含100μmol/L Tempol高糖DMEM培養(yǎng)液);TGF-β阻斷劑SB431542組(含10μmol/L SB431542高糖DMEM培

3、養(yǎng)液);As-IV不同濃度干預組(分別為12.5,25,50,100μmol/L As-IV高糖DMEM培養(yǎng)液)。另設立正常糖組細胞,并用不同濃度(12.5,25,50,100μmol/L)As-IV進行干預。各組細胞孵育48h后,用倒置顯微鏡觀察HMC生長狀況,各組細胞增殖情況采用MTT比色法檢測。根據(jù)檢測結果,選擇藥物最佳作用劑量,并排除滲透壓對細胞的影響。
　　3.根據(jù)MTT的檢測結果,將常規(guī)培養(yǎng)的HMC隨機分為7組:正常組

4、(NG),高糖組(HG),Tempol組(100μmol/L),SB431542組(10μmol/L SB431542),As-IV低,中,高劑量組(25,50,100μmol/L As-IV)。各干預因素處理48h后,采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定(Enzyme-linked immunosorbent assaym,ELISA)法檢測各組細胞上清液中 IV型膠原(collagen typeⅣ,ColⅣ)、基質金屬蛋白酶-9(matrix m

5、etalloproteinase-9,MMP-9)、基質金屬蛋白酶組織抑制物-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)的含量。
　　4.采用二氫二氯熒光素(DCFH-DA)法檢測各組細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量。同時采用Western blot法檢測各組細胞內(nèi)轉化生長因子-β1(Transforming growth fact

6、or-β1,TGF-β1)、p-Smad2/3、NADPH氧化酶4(NADPH oxidase4,NOX4)、TRPC6蛋白的表達。
　　結果:
　　1.鏡下觀察顯示,與正常組相比,高糖組HMC細胞體積變大,數(shù)量增多,細胞之間融合趨勢明顯,表明高糖對HMC具有損傷作用。Tempol、SB431542及不同濃度的As-IV對高糖誘導的細胞肥大均有不同程度的抑制作用,表明As-IV對高糖誘導的細胞損傷具有一定的保護作用。

7、　　2.MTT結果顯示,與正常組相比,高糖組細胞顯著增殖(P<0.01)。Tempol、SB431542及不同濃度的As-IV(12.5,25,50,100μmol/L)對高糖誘導的細胞增殖均有不同程度的抑制作用(P<0.01或P<0.05)。隨著As-IV藥物濃度的增加,其抑制作用也更為顯著。不同濃度的As-IV對正常組細胞增殖無明顯影響,滲透壓對照組與正常組相比,細胞增殖無顯著性差異。
　　3.ELISA結果表明,與正常組相比

8、,高糖組細胞上清液中ColⅣ、TIMP-1、MMP-9含量上升,MMP-9/TIMP-1比值下降(P<0.01)。Tempol、SB431542及不同濃度的As-IV(25,50,100μmol/L)組均可改善高糖誘導上述細胞因子的異常分泌,其中As-IV用藥組呈濃度依賴性,表明As-IV對系膜細胞細胞外基質成分的合成與降解具有調(diào)控作用。
　　4.DCFH-DA結果顯示,與正常組相比,高糖組熒光背景較強,表明高糖組細胞內(nèi)ROS含量

9、顯著升高。Tempol、SB431542及不同濃度的As-IV(25,50,100μmol/L)組均能有效減弱細胞內(nèi)熒光強度,降低HMC細胞內(nèi)ROS含量﹙P<0.01或P<0.05),表明As-IV可有效緩解高糖誘導的氧化應激。
　　5.Western blot結果顯示,與正常組相比,高糖組HMC內(nèi)TGF-β1、p-Smad2/3、NOX4蛋白表達量顯著上升,TRPC6蛋白表達量下降(P<0.01)。與高糖組相比,Tempol、S

10、B431542組細胞內(nèi)TGF-β1、p-Smad2/3、NOX4蛋白表達量顯著下降,TRPC6蛋白表達量明顯上升(P<0.01)。不同濃度的As-IV組均可改善高糖誘導以上蛋白的異常表達(P<0.01或P<0.05),其中100μmol/L濃度組效果最好。
　　結論:
　　As-IV對體外高糖培養(yǎng)的HMC具有保護作用,作用機制可能與其具有抑制細胞增殖、緩解細胞氧化應激狀態(tài)、改善高糖誘導 HMC細胞內(nèi)ColⅣ、MMP-9、TI