靶向調(diào)控核受體FOXO1預(yù)防膽固醇結(jié)石形成的可行性研究.pdf

1、叉頭轉(zhuǎn)錄蛋白(Fox家族)是一組進化過程中保守的轉(zhuǎn)錄因子，有100個以上的成員，其在分化、增殖、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)和代謝方面起著很重要的作用。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO有FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6，它們在哺乳動物的代謝和生長中起著關(guān)鍵的作用，而FoxO1則與代謝性疾病關(guān)系最為密切。近年來體外研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1去磷酸化后，從細胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)，啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，是胰島素抵抗發(fā)生的關(guān)鍵因素，并可能影響肝臟中膽固醇向膽囊的轉(zhuǎn)運

2、。在代謝研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1在肝臟內(nèi)的過表達會增加甘油三酯的蓄積和減少脂肪酸的氧化。而流行病學研究表明，高膽固醇血癥與膽石癥并無正相關(guān)性，而與高甘油三酯血癥有關(guān)。因此，F(xiàn)oxO1在肝臟的過表達，可能就是膽固醇結(jié)石形成的機理所在。代謝綜合征狀態(tài)下，F(xiàn)oxO1的下游分子具有影響脂質(zhì)代謝和糖代謝的作用，其影響過程在于FoxO1的去磷酸化狀態(tài)。生理濃度的胰島素抑制FoxO1，導(dǎo)致刺激Cyp7a1基因轉(zhuǎn)錄，繼而增加膽汁酸的合成?；谝陨侠碚?，本

3、課題的研究通過體外FoxO1過表達及下調(diào)等途徑，分析研究其下游調(diào)節(jié)膽石成因相關(guān)基因的表達;并應(yīng)用重組FoxO1或發(fā)夾小干擾RNA病毒，建立成年小鼠的體內(nèi)FoxO1過表達或下調(diào)的模型，以期揭示FoxO1與膽固醇結(jié)石形成的直接分子機制。
　　目的:應(yīng)用慢病毒感染技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定過表達FOXO1的HepG2細胞株，利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定低表達FOXO1的HepG2細胞株，觀察脂質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達情況。
　　構(gòu)建小鼠FoxO

4、1基因shRNA重組腺病毒載體和FoxO1基因過表達重組腺病毒載體，并經(jīng)C57BL/6小鼠體內(nèi)應(yīng)用，分析FoxO1基因參與膽固醇結(jié)石形成的機制，探討靶向調(diào)控核受體FOXO1預(yù)防膽固醇結(jié)石形成的可行性。
　　方法:
　　一.FOXO1對人肝細胞基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的體外研究
　?。ㄒ唬〧OXO1基因的克隆:應(yīng)用PCR技術(shù)從人肝組織克隆FOXO1基因，選用pEZ_Lv203慢病毒作為載體，借助測序以鑒定結(jié)果。
　?。ǘ﹕h

5、RNA干擾靶點序列的設(shè)計與合成:針對目的基因人FOXO1序列，利用軟件設(shè)計并合成三對shRNA干擾靶點序列，送吉瑪生物科技（上海）有限公司合成，測序鑒定結(jié)果。
　　（三）過表達FOXO1的HepG2細胞株的建立
　　1.構(gòu)建人FOXO1基因過表達重組慢病毒載體:利用PCR技術(shù)從人肝組織克隆FOXO1基因，選用pEZ_Lv203慢病毒載體，送廣州復(fù)能公司合成、包裝并純化pEZ-FOXO1慢病毒。
　　2.穩(wěn)定過表達FOX

6、O1的HepG2細胞株的篩選與鑒定:
　　(1)包裝好FOXO1過表達重組慢病毒感染HepG2細胞，72小時收集細胞，提取RNA和蛋白;實時熒光定量PCR檢測FOXO1 mRNA的表達情況，Western Blot檢測FOXO1蛋白表達情況
　　(2)用1.0μg/mL的嘌呤霉素篩選慢病毒感染的HepG2細胞株，96小時后收集細胞，提取RNA的蛋白;實時熒光定量PCR檢測FOXO1 mRNA的表達情況，WesternBlot

7、檢測FOXO1蛋白表達情況。
　　(3)培養(yǎng)、收集過表達FOXO1的HepG2穩(wěn)定細胞株，提取總RNA和蛋白;實時熒光定量PCR檢測各基因mRNA的表達，對mRNA表達有差異的基因，用WesternBlot檢測其蛋白的表達。
　　（四）穩(wěn)定低表達FOXO1的HepG2細胞株的建立
　　1.構(gòu)建人FOXO1基因shRNA重組慢病毒載體:針對目的基因人FOXO1序列，利用軟件設(shè)計并合成三對shRNA干擾靶點序列，送吉瑪生物

8、科技（上海）有限公司合成、包裝并純化FOXO1 shRNA干擾慢病毒。
　　2.穩(wěn)定低表達FOXO1的HepG2細胞株的篩選與鑒定:
　　(1)包裝好FOXO1 shRNA干擾慢病毒感染HepG2細胞，96小時后收集細胞，提取RNA和蛋白;實時熒光定量PCR檢測FOXO1 mRNA的表達情況，Western Blot檢測FOXO1蛋白表達情況。
　　(2)用1.0μg/mL的嘌呤霉素篩選慢病毒感染的HepG2細胞株，9

9、6小時后收集細胞，提取RNA的蛋白;實時熒光定量PCR檢測FOXO1的mRNA，Western Blot檢測FOXO1蛋白表達情況。
　　(3)培養(yǎng)、收集低表達FOXO1的HepG2穩(wěn)定細胞株，提取總RNA和蛋白;實時熒光定量PCR檢測各基因的mRNA。對mRNA表達有差異的基因，用Western Blot檢測其蛋白的表達情況。
　?。ㄎ澹崟r熒光定量PCR(qRT-PCR):根據(jù)PAXgene RNA kit操作說明書提取

10、細胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳或Agilent2100檢測RNA完整性。按照ABI逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照ABI lifetech Taqman基因表達分析體系說明書在ABI7900上檢測基因表達。擴增后結(jié)果采用2-△△Ct法對檢測結(jié)果進行分析。
　?。￤estern Blot:收集細胞，加入細胞蛋白裂解緩沖液，采用超聲破碎細胞。采用BCA法檢測蛋白濃度。稀釋至相同濃度后上樣，5％濃縮膠電泳80V30mi

11、n，換120V，10％分離膠繼續(xù)電泳60min。400mA轉(zhuǎn)膜120min;5％脫脂牛奶封閉兩小時后，加一抗過夜;二抗孵育2h，顯影拍照。采用Image J分析軟件分析結(jié)果。
　　二、FoxO1基因與膽固醇結(jié)石形成的體內(nèi)研究
　?。ㄒ唬〧oxO1基因的克隆:利用PCR技術(shù)從小鼠肝組織克隆FoxO1基因，選用PDC316-MCS2腺病毒載體，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒M_3Flag-FoxO1，利用測序、WesternBlot方法進行結(jié)果鑒

12、定。
　?。ǘ﹕hRNA干擾靶點序列的設(shè)計與合成:針對目的基因FoxO1序列，利用軟件設(shè)計并合成三對shRNA干擾靶點序列，送吉滿生物科技（上海）有限公司合成，分別插入載體PGMAV-S1腺病毒載體，利用測序、Western Blot方法進行結(jié)果鑒定。
　?。ㄈ┎捎肁dMax系統(tǒng)包裝腺病毒，CsCl密度梯度離心-透析聯(lián)用法純化病毒，梯度稀釋法檢測病毒滴度。
　　（四）動物分組與處理:將40只C57BL/6小鼠隨機分

13、為四組，分別經(jīng)尾靜脈注射對FoxO1基因的shRNA腺病毒（FOXO1-shRNA組）、針對FoxO1基因的shRNA空白載體組（shRNA對照組）、FoxO1基因過表達腺病毒（FOXO1-OE組）、FoxO1基因過表達腺病毒空白載體組（FOXO1-OE對照組），給予膽固醇成石飼料喂養(yǎng)。FoxO1干擾對照組及FoxO1干擾組喂養(yǎng)6周，F(xiàn)oxO1過表達對照組及FoxO1過表達組喂養(yǎng)4周后處死。處死前禁食12小時，自由飲水。
　?。ㄎ?/p>

14、）檢測標本留取:上述各組小鼠用戊巴比妥（4.5mg/100g體質(zhì)量）腹腔注射麻醉，眶周靜脈取血，離心取血清-80℃保存。采用腹部正中切口，暴露膽囊，觀察有無結(jié)石，結(jié)扎膽囊管切除膽囊于液氮凍存。采集肝臟凍于-80℃保存至檢測。
　?。┠懼心懝檀?、磷脂和膽汁酸的測定:取20μL膽汁，加入180μL生理鹽水稀釋10倍，羅氏Modular P全自動生化檢測儀檢測。利用Carey表計算膽固醇飽和指數(shù)(Cholesterol satur

15、ation index，CSI)。
　?。ㄆ撸晒舛縋CR檢測C57BL/6小鼠肝臟脂類代謝轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達變化，對于mRNA表達有差異的基因，用Western Blot檢測其蛋白的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.篩選出穩(wěn)定低表達FOXO1及過表達FOXO1的細胞株各一株
　　(1)篩選的shRNA慢病毒命名為LV3-FOXO1-shRNA2。在RNA水平:感染72小時及96小時，相對于空白對照的相對表達量為

16、0.17和0.19;在蛋白水平:感染72小時及96小時，相對于空白的相對表達量為0.899和0.848。而過表達慢病毒pEX-FOXO1，在RNA水平:感染72小時及96小時，相對于空白相對表達量為8.94和6.17;在蛋白水平:感染72小時及96小時，相對于空白相對表達量為0.027和1.400。
　　(2)篩選培養(yǎng)96小時后，LV3-FOXO1-shRNA2 mRNA表達為空白對照的0.527(n=3，P＜0.05)，蛋白表達

17、為空白對照的0.62(n=3，P＜0.05);pEX-FOXO1mRNA表達為空白對照的105.10(n=3，P＜0.05)，蛋白表達為空白對照的2.01(n=3，P＜0.05)。
　　2.FOXO1對CYP7A1及FXR基因表達的影響
　　FOXO1基因低表達時，CYP7A1基因表達上調(diào)約4倍(t=21.03，P＜0.01)，F(xiàn)XR基因上調(diào)約1.4倍(t=3.047，P＜0.05);FOXO1高表達時，CYP7A1基因表達

18、下調(diào)約4倍(t=21.85，P＜0.01)，F(xiàn)XR基因下調(diào)約0.8倍(t=12.62，P＜0.05)，具有統(tǒng)計學意義。
　　3.成功構(gòu)建FoxO1過表達及FoxO1低表達腺病毒載體
　　(1)FoxO1過表達腺病毒載體轉(zhuǎn)染293T細胞培養(yǎng)48h后提取蛋白。Western Blot檢測結(jié)果顯示構(gòu)建載體能在293T細胞表達，提示載體構(gòu)建成功。
　　(2)構(gòu)建的三個FoxO1 shRNA干擾腺病毒感染鼠ST2細胞，培養(yǎng)72h

19、，提取總蛋白。根據(jù)Western blot結(jié)果選擇干擾效果最好的，繼續(xù)擴增，用于后續(xù)實驗。
　　(3)擴增構(gòu)建的腺病毒滴度結(jié)果:獲得滴度為1×1011PFU/mL的FoxO1過表達(FoxO1-OE)和FoxO1干擾(FoxO1-shRNA)腺病毒。
　　4.體內(nèi)干預(yù)試驗結(jié)果
　　(1)FoxO1過表達組及FoxO1過表達對照組，致石飲食喂養(yǎng)4周后，麻醉處死，觀察膽囊成石情況，取標本。FoxO1過表達對照組，4只成石(

20、4/10)，成石率40％;FoxO1過表達組，8只成石(8/10)，成石率80％。FoxO1干擾組組及FoxO1干擾對照組，致石飲食喂養(yǎng)6周后，麻醉處死，觀察膽囊成石情況，取標本。FoxO1干擾對照組，10只成石(10/10)，成石率100％; FoxO1干擾組，2只成石(2/10)，成石率20％。
　　(2)與對照組相比，F(xiàn)oxO1干擾組膽囊膽汁總膽固醇明顯下降，總膽汁酸明顯升高，CSI明顯降低，具有統(tǒng)計學意義。磷脂變化沒有統(tǒng)計

21、學意義，呈降低趨勢。而FoxO1過表達組各指標變化呈相反趨勢。
　　(3)小鼠血清的血脂檢測結(jié)果顯示:與FoxO1干擾對照組相比，F(xiàn)oxO1干擾組小鼠血清CHOL、LDLC及LDL/HDL水平均下降，差異有統(tǒng)計學意義。TG、GLU及HDLC則沒有明顯差異。相對于FoxO1過表達對照組，F(xiàn)oxO1過表達組小鼠血清CHOL、LDLC及LDL/HDL均升高，差異具有統(tǒng)計學意義。TG、GLU沒有明顯差異。
　　(4)基因相對表達量檢

22、測結(jié)果顯示:與對照組相比，F(xiàn)oxO1干擾組的基因Cyp7a1和Fxr表達明顯升高。而FoxO1過表達則呈相反結(jié)果。在FoxO1干擾的抗結(jié)石組我們發(fā)現(xiàn)，Cyp7b1、Cyp8b1和Cyp27a1與對照組相比均呈上升趨勢，其中Cyp8b1升高明顯，具有統(tǒng)計學意義。
　　(5)蛋白免疫印跡實驗顯示:與對照組相比，F(xiàn)oxO1干擾組的蛋白Cyp7a1和Fxr表達明顯升高。而FoxO1過表達組則呈相反結(jié)果。這一結(jié)果與基因研究結(jié)果相一致。

23、>　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建FOXO1低表達和高表達慢病毒載體。感染HepG2后，篩選出低表達FOXO1和高表達FOXO1的穩(wěn)定細胞株，構(gòu)建了細胞模型。
　　2.構(gòu)建了FoxO1低表達和高表達腺病毒載體，經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠，成功復(fù)制出低表達FoxO1和高表達FoxO1的小鼠模型。
　　3.隨著FOXO1基因表達水平的變化，CYP7A1和FXR基因的表達水平發(fā)生改變，而ABCG5、ABCG8、ABCB11等

24、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運基因沒有相應(yīng)的改變。提示，F(xiàn)OXO1基因可能通過影響膽固醇和膽汁酸的代謝而參與膽固醇結(jié)石的形成。體內(nèi)干預(yù)試驗結(jié)果也顯示，F(xiàn)oxO1在小鼠體內(nèi)過表達時具有一定的促成石作用。FoxO1的shRNA干擾腺病毒，在小鼠具有明顯的抗成石效果。提示FoxO1作為預(yù)防和治療膽囊膽固醇結(jié)石靶點的可行性。
　　4.進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)，當FoxO1基因表達發(fā)生變化時，引起Cyp7a1和Fxr基因的表達改變，而Abcg5、Abcg8、Abcb