FoxO1在酒精性脂肪性肝病中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）是一種由于長(zhǎng)期大量飲酒引起的中毒性肝臟疾病，肝臟病理改變最初表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變性，其后發(fā)展為肝炎、肝纖維化，最終出現(xiàn)肝硬化。酒精性脂肪性肝病(alcohol fatty liver disease,AFLD)是ALD的早期表現(xiàn)。課題組應(yīng)用酒精灌胃建立大鼠AFLD模型，發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機(jī)理主要是脂質(zhì)代謝紊亂導(dǎo)致大量脂質(zhì)沉積于肝細(xì)胞，從而引起肝細(xì)胞脂肪變性。大量研究表明叉頭

2、樣轉(zhuǎn)錄因子O1（forkhead transcription factor O1，F(xiàn)oxO1）參與脂質(zhì)代謝及氧化應(yīng)激。FoxO1受轉(zhuǎn)錄后修飾（磷酸化、乙?；?、泛素化等）關(guān)聯(lián)的亞細(xì)胞定位調(diào)節(jié)。定位于細(xì)胞核內(nèi)的FoxO1，能結(jié)合相應(yīng)的DNA序列，調(diào)控下游分子的表達(dá)。微粒體 TG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(microsomal triglyceride transfer protein，MTP)及脂聯(lián)素受體2（adiponectin recpetor2，Adi

3、poR2）受FoxO1的調(diào)控。課題組前期發(fā)現(xiàn)酒精抑制沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator1，SIRT1）的活性，并選擇性抑制脂聯(lián)素受體2（adiponectin recpetor2，AdipoR2）的表達(dá)。FoxO1可能是SIRT1與AdipoR2連接樞紐，酒精抑制SIRT1的活性，導(dǎo)致FoxO1的去乙?；瘻p少，乙?；龆?，從而使其定位于細(xì)胞質(zhì)增多、核定位減少，削弱FoxO1的DNA結(jié)合能力，減弱

4、其轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致AdipoR2的表達(dá)減少，造成其下游一系列脂代謝過(guò)程紊亂。微粒體TG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(microsomal triglyceride transfer protein，MTP作為 FoxO1的下游蛋白，在極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）的組裝與分泌中起著重要作用，參與脂質(zhì)向細(xì)胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)。酒精引起FoxO1的轉(zhuǎn)錄活性減弱可能造成MTP的表達(dá)變化，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積。研究通過(guò)酒精

5、灌胃法建立大鼠 AFLD的模型，應(yīng)用分子生物學(xué)方法探討FoxO1及其下游蛋白MTP在不同時(shí)間段的表達(dá)情況，探索FoxO1在AFLD中的作用。
　　方法：選用健康雄性Wister大鼠50只，體重200±20g，正常飼養(yǎng)7天,隨機(jī)分出10只為正常對(duì)照組（即0周），余40只用酒精灌胃，于第4周末隨機(jī)處死大鼠10只、8周末9只、12周末8只、16周末8只；處死后立即取出肝組織，剪取部分肝組織給予10％福爾馬林液固定，過(guò)夜后石蠟包埋切片，剩

6、余肝組織經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶連反應(yīng)（Real Time-quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR）檢測(cè)FoxO1 mRNA的表達(dá)，應(yīng)用免疫沉淀法提取乙酰化蛋白，應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)FoxO1總蛋白、乙?；疐oxO1蛋白及MTP表達(dá)水平。應(yīng)用免疫組化比較細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)FoxO1的表達(dá)情況。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。<

7、br>　　結(jié)果：
　　1.肝臟組織病理學(xué)改變：應(yīng)用蘇丹Ⅳ染色法顯示，正常對(duì)照組（0周組）未見(jiàn)脂肪變，隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，肝細(xì)胞橘紅色脂滴逐漸增多，提示大鼠酒精性脂肪性肝病模型造模成功。
　　免疫組化法檢測(cè)肝細(xì)胞FoxO1的表達(dá)：對(duì)照組及造模早期（4周組），F(xiàn)oxO1的表達(dá)量少，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)oxO1表達(dá)量逐漸增多，尤其在細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)增加顯著（見(jiàn)Fig.1-5）。
　　2.RT-qPCR法檢測(cè)FoxO1 mRNA的

8、表達(dá)：正常組大鼠肝細(xì)胞中FoxO1mRNA表達(dá)較少，隨著酒精喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)oxO1mRNA表達(dá)成逐漸增多趨勢(shì)（見(jiàn)Fig.7及Table2）。
　　3.Westren blot法檢測(cè)總FoxO1蛋白的表達(dá)：正常組大鼠肝細(xì)胞中總FoxO1蛋白表達(dá)較少，造模前期，總FoxO1蛋白的表達(dá)量增多不明顯，（0周與4周組比較P>0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異），8周后總FoxO1蛋白量呈逐漸增多趨勢(shì)（見(jiàn)Fig.6、Fig.8及Table3）。

9、>　　4.為進(jìn)一步探究FoxO1的活性，應(yīng)用Westren blot法檢測(cè)Ac-FoxO1蛋白的表達(dá)：正常組大鼠肝細(xì)胞中Ac-FoxO1蛋白表達(dá)較少，隨著酒精造模時(shí)間的延長(zhǎng)，Ac-FoxO1蛋白量逐漸增多，且FoxO1的乙酰化水平（Ac-FoxO1/總FoxO1）呈逐漸升高趨勢(shì)（見(jiàn)Fig.6、Fig.10及Table4）。
　　5.Westren blot法檢測(cè)MTP蛋白的表達(dá)：正常組大鼠肝組織中表達(dá)MTP較多，隨著酒精造模時(shí)間的