2型糖尿病患者血清Klotho蛋白水平變化與視網(wǎng)膜病變的關(guān)系及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、2型糖尿病患者血清Klotho蛋白水平變化與視網(wǎng)膜病變及氧化應(yīng)激指標(biāo)之間的相關(guān)性
　　目的：觀察2型糖尿病患者血清Klotho（KL）蛋白水平變化及與視網(wǎng)膜病變（DR）、氧化應(yīng)激指標(biāo)之間的相關(guān)性。
　　方法：選取17例健康者（NC組）與60例2型糖尿病患者（DM組）作為研究對(duì)象，對(duì)DM組患者行熒光素眼底血管造影檢查，根據(jù)有無(wú)合并視網(wǎng)膜病變以及病變的嚴(yán)重程度，分為不合并視網(wǎng)膜病變的糖尿病組（NDR組）、非增殖期糖尿病

2、視網(wǎng)膜病變組（NPDR組）及增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變組（PDR組）。收集研究者的人體測(cè)量學(xué)及生化指標(biāo)，計(jì)算身體質(zhì)量指數(shù)（BMI）。留取靜脈血分離血清標(biāo)本，利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）測(cè)定血清KL蛋白水平，硫代巴比妥酸法測(cè)定血清丙二醛（MDA）含量，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定血清超氧化物歧化酶（SOD）活性。比較各組間血清KL蛋白變化，分析KL蛋白與DR及SOD、MDA之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　（1）各組間血清 KL蛋白水

3、平比較：與NC組相比，血清KL蛋白水平在DM組明顯降低。亞組分析結(jié)果顯示，血清KL蛋白水平在NDR、NPDR及PDR三組間呈逐漸降低趨勢(shì)，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　?。?）血清KL蛋白與DR相關(guān)性分析：Spearman分析顯示，血清KL蛋白與DR之間呈顯著負(fù)相關(guān)。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，KL蛋白水平降低是DR的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　?。?）各組間氧化應(yīng)激指標(biāo)比較：與NC組相比，血清SOD活力在DM組顯著下降，而MDA含量

4、顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在NDR、NPDR及PDR亞組中，SOD活力逐漸降低，MDA含量逐漸升高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　（4）血清KL蛋白與SOD、MDA之間相關(guān)性分析：在糖尿病人群中，Spearman分析顯示，血清KL蛋白與SOD活力呈顯著正相關(guān)，而與MDA呈顯著負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步行多元線性逐步回歸分析，結(jié)果顯示，血清KL蛋白水平與SOD之間呈獨(dú)立正相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)論：KL蛋白在糖尿病患者血清中表達(dá)水平顯著降低

5、，且隨視網(wǎng)膜病變程度的加重呈逐漸降低趨勢(shì)，是DR的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。糖尿病患者體內(nèi)氧化能力增強(qiáng)，抗氧化能力減弱，血清KL蛋白水平與SOD之間密切相關(guān)。
　　第二部分、Klotho蛋白對(duì)棕櫚酸誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及活性氧產(chǎn)生的影響及機(jī)制探究
　　目的：體外給予重組Klotho（KL）蛋白干預(yù)，觀察KL蛋白對(duì)棕櫚酸（PA）誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞（HRECs）凋亡和活性氧（ROS）產(chǎn)生的影響，并進(jìn)行機(jī)制探究。
　　方法：體

6、外利用葡萄糖濃度為15mmol/L的培養(yǎng)基為背景，模擬糖尿病狀態(tài)下的高糖環(huán)境，培養(yǎng)HRECs細(xì)胞，然后將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照（Ctr）組、PA組、PA+KL組及PA+KL+LY294002組，干預(yù)24小時(shí)后收集細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，提取蛋白行W檢測(cè)凋亡相關(guān)指標(biāo)Bax、Bcl-2及Cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)水平，DCFH-DA（2’7’-dichlorofluorescein diacetate）法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RO

7、S水平。
　　結(jié)果：與Ctr組相比，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，PA組細(xì)胞凋亡率顯著增高（P＜0.05）。Western blot數(shù)據(jù)示PA組抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少，促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase3表達(dá)升高，Bcl-2/Bax比值下降（P＜0.05）。另外，DCFH-DA熒光染色示PA組細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高。以上數(shù)據(jù)提示PA能夠成功誘導(dǎo)HRECs細(xì)胞凋亡及ROS產(chǎn)生。給予KL蛋白處理后，結(jié)果顯示PA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋

8、亡率顯著下降，Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax及Cleaved-caspase3表達(dá)下調(diào)，Bcl-2/Bax比值升高（P＜0.05），同時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS水平減弱。提示KL蛋白能夠?qū)筆A對(duì)細(xì)胞的損害作用。此外結(jié)果顯示，PA干預(yù)后細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），而給予KL蛋白處理后p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著恢復(fù)（P＜0.05）。隨后給予PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑LY294002處理，結(jié)果示KL蛋白對(duì)PA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及RO