2型糖尿病患者血清Klotho蛋白水平變化與視網(wǎng)膜病變的關系及機制研究.pdf

1、第一部分、2型糖尿病患者血清Klotho蛋白水平變化與視網(wǎng)膜病變及氧化應激指標之間的相關性
　　目的：觀察2型糖尿病患者血清Klotho（KL）蛋白水平變化及與視網(wǎng)膜病變（DR）、氧化應激指標之間的相關性。
　　方法：選取17例健康者（NC組）與60例2型糖尿病患者（DM組）作為研究對象，對DM組患者行熒光素眼底血管造影檢查，根據(jù)有無合并視網(wǎng)膜病變以及病變的嚴重程度，分為不合并視網(wǎng)膜病變的糖尿病組（NDR組）、非增殖期糖尿病

2、視網(wǎng)膜病變組（NPDR組）及增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變組（PDR組）。收集研究者的人體測量學及生化指標，計算身體質量指數(shù)（BMI）。留取靜脈血分離血清標本，利用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）測定血清KL蛋白水平，硫代巴比妥酸法測定血清丙二醛（MDA）含量，黃嘌呤氧化酶法測定血清超氧化物歧化酶（SOD）活性。比較各組間血清KL蛋白變化，分析KL蛋白與DR及SOD、MDA之間的相關性。
　　結果：
　?。?）各組間血清 KL蛋白水

3、平比較：與NC組相比，血清KL蛋白水平在DM組明顯降低。亞組分析結果顯示，血清KL蛋白水平在NDR、NPDR及PDR三組間呈逐漸降低趨勢，組間比較具有統(tǒng)計學差異。
　?。?）血清KL蛋白與DR相關性分析：Spearman分析顯示，血清KL蛋白與DR之間呈顯著負相關。Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，KL蛋白水平降低是DR的獨立危險因素。
　?。?）各組間氧化應激指標比較：與NC組相比，血清SOD活力在DM組顯著下降，而MDA含量

4、顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義。在NDR、NPDR及PDR亞組中，SOD活力逐漸降低，MDA含量逐漸升高，組間差異具有統(tǒng)計學意義。
　　（4）血清KL蛋白與SOD、MDA之間相關性分析：在糖尿病人群中，Spearman分析顯示，血清KL蛋白與SOD活力呈顯著正相關，而與MDA呈顯著負相關。進一步行多元線性逐步回歸分析，結果顯示，血清KL蛋白水平與SOD之間呈獨立正相關關系。
　　結論：KL蛋白在糖尿病患者血清中表達水平顯著降低

5、，且隨視網(wǎng)膜病變程度的加重呈逐漸降低趨勢，是DR的獨立危險因素。糖尿病患者體內氧化能力增強，抗氧化能力減弱，血清KL蛋白水平與SOD之間密切相關。
　　第二部分、Klotho蛋白對棕櫚酸誘導的人視網(wǎng)膜內皮細胞凋亡及活性氧產(chǎn)生的影響及機制探究
　　目的：體外給予重組Klotho（KL）蛋白干預，觀察KL蛋白對棕櫚酸（PA）誘導的人視網(wǎng)膜內皮細胞（HRECs）凋亡和活性氧（ROS）產(chǎn)生的影響，并進行機制探究。
　　方法：體

6、外利用葡萄糖濃度為15mmol/L的培養(yǎng)基為背景，模擬糖尿病狀態(tài)下的高糖環(huán)境，培養(yǎng)HRECs細胞，然后將細胞隨機分為對照（Ctr）組、PA組、PA+KL組及PA+KL+LY294002組，干預24小時后收集細胞，采用流式細胞術檢測細胞凋亡率，提取蛋白行W檢測凋亡相關指標Bax、Bcl-2及Cleaved-caspase3的蛋白表達水平，DCFH-DA（2’7’-dichlorofluorescein diacetate）法檢測細胞內RO

7、S水平。
　　結果：與Ctr組相比，流式細胞術檢測結果顯示，PA組細胞凋亡率顯著增高（P＜0.05）。Western blot數(shù)據(jù)示PA組抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少，促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase3表達升高，Bcl-2/Bax比值下降（P＜0.05）。另外，DCFH-DA熒光染色示PA組細胞內ROS水平升高。以上數(shù)據(jù)提示PA能夠成功誘導HRECs細胞凋亡及ROS產(chǎn)生。給予KL蛋白處理后，結果顯示PA誘導的細胞凋

8、亡率顯著下降，Bcl-2表達上調，Bax及Cleaved-caspase3表達下調，Bcl-2/Bax比值升高（P＜0.05），同時細胞內ROS水平減弱。提示KL蛋白能夠對抗PA對細胞的損害作用。此外結果顯示，PA干預后細胞p-Akt蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05），而給予KL蛋白處理后p-Akt蛋白表達水平顯著恢復（P＜0.05）。隨后給予PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002處理，結果示KL蛋白對PA誘導的細胞凋亡及RO