甲狀腺乳頭狀癌BRAF600E突變與HMGB1表達的關(guān)聯(lián).pdf

1、目的：
　　探索在甲狀腺乳頭狀癌(PTC)中BRAFV600E突變對高遷移率族蛋白（HMGB1）表達的影響，尋求BRAF基因影響PTC發(fā)展及預(yù)后的機制。
　　方法：
　　收集2015年9月至2015年12月我院甲狀腺外科收治的44例PTC患者的術(shù)前血清及術(shù)后新鮮病理組織，組織提取DNA進行基因測序。根據(jù)測序結(jié)果有無BRAFV600E突變將患者分為BRAFV600E突變陽性組和BRAFV600E突變陰性組。運用免疫組化和

2、免疫印跡法（Western blot）檢測組織中HMGB1蛋白的分布和表達量；熒光定量PCR（qPCR）檢測組織中HMGB1mRNA的水平；應(yīng)用ELISA法檢測血清中HMGB1蛋白的水平。Western blot檢測4種細胞系中HMGB1蛋白的表達，再通過反向PCR法（Inverse PCR）以pBABEbleo-Flag-BRAFV600E突變質(zhì)粒為骨架，構(gòu)建無BRAFV600E突變的質(zhì)粒，通過與BRAF野生型CAL-62細胞進行轉(zhuǎn)染

3、分別構(gòu)建過表達BRAFV600E突變型和BRAF野生型兩組細胞系。CAL-62、BHT-101和過表達的兩組細胞行MAPK通路抑制的作為實驗組，并設(shè)置對照。用Western blot檢測Phospho-p44/42和HMGB1的蛋白表達。Western blot數(shù)據(jù)應(yīng)用Image J軟件計算灰度值，熒光定量PCR數(shù)據(jù)用2-△Ct進行相對定量分析，用ELISA Calc回歸/擬合計算程序計算血清中的HMGB1蛋白濃度。所得數(shù)據(jù)均采用SPS

4、S20.0進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：
　　1、在PTC組織中，HMGB1蛋白主要定位于胞漿，BRAFV600E突變陽性組HMGB1的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平均顯著低于BRAFV600E突變陰性組（Z=2.117，P＜0.01；X2=19.989，P＜0.05），而這種變化在外周血中并未呈現(xiàn)（t=1.135, P＞0.05）。BRAFV600E突變增加淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和甲狀腺外浸潤的風(fēng)險（X2=6.117，P＜0.05；X2=5.587，

5、P＜0.05）。
　　2、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC中的HMGB1mRNA和蛋白的表達量均顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PTC（Z=-2.216，P＜0.05；t=-2.217, P＜0.05），發(fā)生腺體外浸潤的PTC也呈現(xiàn)此種趨勢（Z=-2.267，P＜0.05；t=-3.885,P＜0.01）。
　　3、在4種細胞系中，HMGB1在BRAF野生型細胞中的表達量高于BRAFV600E突變型細胞（z=-2.415，P＜0.05）；在過表達

6、的BRAF野生型和BRAFV600E突變型細胞系中也呈現(xiàn)此趨勢。加入U0126后，無論BRAF野生型的細胞還是攜帶BRAFV600E突變型細胞，HMGB1的表達量均增加；HMGB1在兩組細胞中的表達趨勢一致，但在BRAFV600E突變型細胞中的變化高于BRAF野生型細胞。
　　結(jié)論：
　　青島地區(qū)PTC患者的BRAFV600E基因突變率高，BRAFV600E基因突變檢測可以作為PTC預(yù)后的輔助指標(biāo)。BRAFV600E基因突變