巨大芽孢桿菌N6谷氨酰胺合成酶酶學(xué)性質(zhì)的研究和改良.pdf

1、谷氨酰胺合成酶(GS)廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)，能夠利用ATP提供的能量催化合成谷氨酰胺，與生物的氮代謝密切相關(guān)。此外，研究中發(fā)現(xiàn)部分GS也能催化乙胺和谷氨酸生成茶氨酸。谷氨酰胺有很好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，茶氨酸是很好的保健品，這兩種化合物均有巨大的市場(chǎng)，所以GS有很好的工業(yè)應(yīng)用潛力。因此，研究針對(duì)本室篩選的擁有GS活性的巨大芽孢桿菌N6展開了工作，取得了以下結(jié)果:
　　根據(jù)巨大芽孢桿菌相關(guān)基因組信息設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增

2、得到目的基因BGS。測(cè)序得知BGS有1335bp，共有氨基酸444個(gè)，分子量約為50.4kDa。經(jīng)比對(duì)與枯草芽孢桿菌的GS的相似性最高(88％)。純化產(chǎn)物酶學(xué)性質(zhì)檢測(cè)表明，最適反應(yīng)溫度為30℃，最適反應(yīng)pH為7.0。該酶在55℃的條件下保溫2.5h后，BGS仍有高達(dá)90％的活性，在65℃條件下保溫1h后，仍有50％的活性。通過(guò)薄層層析和HPLC驗(yàn)證該酶具有合成茶氨酸的活性。
　　為了改良BGS的酶學(xué)性質(zhì)，利用隨機(jī)突變和定點(diǎn)突變技術(shù)

3、對(duì)該基因進(jìn)行體外定向進(jìn)化。通過(guò)易錯(cuò)PCR構(gòu)建了隨機(jī)突變文庫(kù)，從8000個(gè)轉(zhuǎn)化子中篩選獲得了2個(gè)突變株:F1-D10(D198G)、F1-F10(I28T、L159I)。經(jīng)測(cè)定，F(xiàn)1-D10對(duì)ADP的催化效率提高了33％，對(duì)谷氨酰胺的催化效率下降了20％，對(duì)鹽酸羥胺的催化效率提高了79％;F1-F10對(duì)ADP的催化效率提高了65.7倍，對(duì)谷氨酰胺的催化效率提高了56％，對(duì)鹽酸羥胺的催化效率提高了67％。對(duì)F1-F10進(jìn)行回復(fù)突變，構(gòu)建了I

4、28T和L159I，其中L159I對(duì)ADP、谷氨酰胺、鹽酸羥胺的催化效率分別提高了93.7倍，2.5倍和3.2倍。通過(guò)多序列比對(duì)和同源建模方法選取了7個(gè)距離活性中心比較近的位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變。結(jié)果表明，E65A與野生型相比對(duì)ADP、谷氨酰胺、鹽酸羥胺的催化效率分別提高了154.7倍、1.4倍和2倍。為了探討不同突變位點(diǎn)是否存在疊合效果，構(gòu)建了E65A/D198G，結(jié)果并未產(chǎn)生疊加效應(yīng)。對(duì)E65A，L159I酶學(xué)性質(zhì)研究表明，與野生型相比

5、E65A的最適溫度由30℃變?yōu)?0℃，L159I的最適溫度變?yōu)?5℃。同時(shí)，L159I的熱穩(wěn)定性得到了顯著提升，在65℃水浴2.5h后還有90％的活性，而野生型在相同的條件下僅剩15％。在合成茶氨酸方面，L159I較野生型產(chǎn)量提高了35％。結(jié)構(gòu)模擬的結(jié)果顯示，L159I的159位的Leu變?yōu)镮le，使得兩個(gè)單體之間的空間位阻變小，附近氫鍵結(jié)合更緊密。65位的Glu變?yōu)锳la不僅使催化位點(diǎn)更容易暴露而且使活性空腔開口變大，反應(yīng)底物更易進(jìn)入