甜瓜谷氨酰胺合成酶基因的克隆及其表達(dá)分析研究.pdf

1、植物對(duì)氮素的吸收利用能力是植物生長(zhǎng)發(fā)育重要的限制因素之一。谷氨酰胺合成酶（GS）在高等植物氮代謝中起著重要的作用。植物谷氨酰胺合成酶具有多種同工酶，根據(jù)亞細(xì)胞定位，分為胞液型谷氨酰胺合成酶（GS1）和質(zhì)體型谷氨酰胺合成酶（GS2）。本研究從網(wǎng)紋甜瓜中克隆了一個(gè)質(zhì)體型谷氨酰胺合成酶的基因并且研究了該基因的表達(dá)模式。 甜瓜是世界十大果品之一，是我國(guó)重要的一種設(shè)施栽培作物。利用RACE-PCR方法在甜瓜葉片中克隆了一個(gè)谷氨酰胺合成酶基

2、因M-GS2 (Melon-Glutamine Synthetase Gene, GenBank accession number: AY773090)，并利用生物信息學(xué)手段對(duì)其主要結(jié)構(gòu)特征和功能特征進(jìn)行了分析。該基因全長(zhǎng)1807 bp，包括170bp 的5’非翻譯區(qū)（UTR）和341 bp 的3’非翻譯區(qū)。此序列含有一個(gè)1296 bp的開放閱讀框（ORF），編碼一個(gè)432個(gè)氨基酸殘基的多肽，推測(cè)的多肽分子量大小為477 kDa，PI=

3、8.06。經(jīng)生物信息學(xué)分析這個(gè)多肽是谷氨酰胺合成酶的前體，在這個(gè)多肽的N-端有一個(gè)53個(gè)氨基酸殘基的穿越肽段，這個(gè)多肽定位于葉綠體內(nèi)。氨基酸序列和結(jié)構(gòu)分析顯示M-GS2編碼的這個(gè)蛋白包含了一個(gè)GS beta-Grasp 功能區(qū)和GS 催化功能區(qū)，這些功能區(qū)在植物的谷氨酰胺合成酶中是保守的。進(jìn)化樹分析表明M-GS2和黑核桃（Juglans nigra.）GS2最相近。在研究不同組織中表達(dá)模式的分析中表明M-GS2優(yōu)先在葉中表達(dá)，在莖、花和

4、果實(shí)中表達(dá)較少，而在根中幾乎不表達(dá)。 進(jìn)一步研究了網(wǎng)紋甜瓜質(zhì)體型谷氨酰胺合成酶（M-GS2）的表達(dá)模式。試驗(yàn)通過對(duì)甜瓜不同處理，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對(duì)甜瓜質(zhì)體型谷氨酰胺合成酶（M-GS2）基因進(jìn)行mRNA的表達(dá)檢測(cè)，首先分別提取甜瓜幼嫩的根、莖、葉、花和果實(shí)組織的總RNA，利用半定量RT-PCR的方法研究了甜瓜M-GS2基因的組織特異性表達(dá)。結(jié)果表明M-GS2基因優(yōu)先在葉中表達(dá)。其次研究了在不同生理?xiàng)l件下M-G

5、S2基因的表達(dá)模式，結(jié)果顯示在硝態(tài)氮處理下，隨著氮濃度的增加，M-GS2基因的表達(dá)量增高，但是隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。在銨態(tài)氮處理下，處理初期M-GS2基因的表達(dá)量隨著氮濃度的增大而降低，而后隨著氮濃度的增加而升高。結(jié)果表明，M-GS2基因的表達(dá)水平隨著氮素濃度的提高而升高，升高的比例因氮源形態(tài)以及處理時(shí)間有所不同。不同氮形態(tài)比例的氮源對(duì)M-GS2基因表達(dá)的影響無明顯的規(guī)律。總體來看，混合態(tài)氮有利于甜瓜的生長(zhǎng)發(fā)育，單一種類的氮肥作用較