星形膠質(zhì)細(xì)胞中谷氨酰胺合成酶功能的相關(guān)研究.pdf

1、膠質(zhì)細(xì)胞的谷氨酰胺合成酶(GS)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中發(fā)揮著調(diào)節(jié)谷氨酸和谷氨酰胺平衡的重要作用，它能根據(jù)需要把細(xì)胞攝取的谷氨酸轉(zhuǎn)化為無(wú)神經(jīng)毒性的谷氨酰胺提供給神經(jīng)元。GS在大多數(shù)的星形膠質(zhì)細(xì)胞(AS)都有表達(dá)，是AS行使興奮性毒性保護(hù)作用的主要功能單位。目前，對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞中GS功能方面的研究主要集中于與谷氨酸代謝相關(guān)的一些領(lǐng)域，其他方面的研究很少觸及。CNS損傷后GS的表達(dá)格局和功能變化及調(diào)控方面的研究也相對(duì)較少，而且存在諸多爭(zhēng)

2、論。本研究課題旨在通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)加深和開闊對(duì)GS功能的了解，為CNS損傷和疾病機(jī)制的研究提供一些新的思路。
　　 本文第一部分研究的主要目的是了解GS對(duì)AS谷氨酸攝取的影響及TNF-α對(duì)GS的負(fù)性調(diào)控作用，為研究GS在CNS中的生物學(xué)功能提供新的線索。在研究中我們通過(guò)特異性抑制劑MSO和轉(zhuǎn)基因手段降低或增高AS中GS的水平，觀察其對(duì)谷氨酸攝取的影響；通過(guò)western blot觀察TNF-α對(duì)GS表達(dá)的影響；建立神經(jīng)元-星形膠質(zhì)

3、細(xì)胞共培養(yǎng)體系，通過(guò)改變GS水平觀察AS對(duì)谷氨酸興奮性毒性的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　 (1)谷氨酸可以促進(jìn)AS中GS活性和表達(dá)水平的上調(diào)。
　　 (2)通過(guò)MSO和過(guò)表達(dá)改變細(xì)胞內(nèi)GS水平，可以影響AS對(duì)谷氨酸的攝?。煌瑫r(shí)也影響GS對(duì)谷氨酸的轉(zhuǎn)化效率，從而降低谷氨酰胺的產(chǎn)生。
　　 (3)TNF-α可以抑制GS的表達(dá)和活化，從而降低AS對(duì)谷氨酸的攝取和轉(zhuǎn)化。
　　 (4)谷氨酸對(duì)神經(jīng)元有明顯的毒性，在缺

4、乏谷氨酰胺的環(huán)境中神經(jīng)元生長(zhǎng)不良，AS可以把細(xì)胞外谷氨酸通過(guò)GS轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元所需的谷氨酰胺，從而對(duì)興奮性毒性產(chǎn)生保護(hù)作用；TNF-α可以通過(guò)其對(duì)GS的抑制作用降低AS對(duì)谷氨酸的攝取和利用，從而削弱AS對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。
　　 本文第二部分研究的主要目的是了解脊髓損傷(SCI)后GS的表達(dá)分布格局的變化，以及與組織中谷氨酸濃度變化的關(guān)系，為研究GS在CNS損傷中的作用提供依據(jù)。在研究中我們首先建立了大鼠脊髓重物撞擊傷模型，通過(guò)免

5、疫雙熒光和免疫組化技術(shù)分析GS在SCI前后表達(dá)格局的變化；通過(guò)酶法直接檢測(cè)組織中谷氨酸濃度和GS的活性水平；通過(guò)western blot分析GS蛋白水平的變化以及與AS反應(yīng)性的關(guān)系。由此為更好的了解AS在SCI后的功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為神經(jīng)退行性疾病和CNS損傷的臨床治療提供一種新的思路。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
　　 (1)SCI后極短時(shí)間內(nèi)組織中谷氨酸濃度便迅速上升又很快恢復(fù)到損傷前水平，而GS的活性水平經(jīng)歷了一個(gè)先抑后揚(yáng)的變化過(guò)程。

6、>　　 (2)正常脊髓中GS主要表達(dá)于三類膠質(zhì)細(xì)胞，即星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，損傷后這種格局未發(fā)生改變；在損傷中央部位出現(xiàn)的大量炎癥細(xì)胞也有GS的高表達(dá)。
　　 (3)SCI后GS蛋白水平經(jīng)歷了一個(gè)先降低后升高，在損傷后期又恢復(fù)至損傷前水平的變化過(guò)程，與星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化進(jìn)程大體協(xié)調(diào)又不完全一致。
　　 本文第三部分研究的目的是探討GS對(duì)AS體外損傷后遷移的影響，為研究GS在反應(yīng)性AS中的作用提供實(shí)驗(yàn)依

7、據(jù)，為GS的功能研究提供一種全新的角度，也為更好的了解CNS損傷后AS的活化機(jī)制提供一些幫助。在研究中我們建立了AS的體外劃痕損傷模型，用Ara-c抑制細(xì)胞的增殖，對(duì)損傷后GS的表達(dá)變化和分布格局進(jìn)行了檢測(cè)。通過(guò)基因敲除和過(guò)表達(dá)手段分析GS對(duì)細(xì)胞的遷移和黏附的影響。并通過(guò)RT-PCR對(duì)整合素(integrinβ)，金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP-2，MT1-MMP)的檢測(cè)，初步探討了GS影響AS遷移的分子機(jī)制。結(jié)果顯示：
　　 (1)A

8、S損傷后GS表達(dá)水平明顯下調(diào)，空間分布上GS的下調(diào)主要出現(xiàn)在臨近損傷區(qū)和正在遷移的AS。
　　 (2)通過(guò)MSO抑制GS水平可以促進(jìn)損傷后AS的遷移；而通過(guò)DEX誘導(dǎo)GS的表達(dá)可以抑制AS的遷移。
　　 (3)通過(guò)RNA干擾降低GS水平可以促進(jìn)AS的遷移卻降低其黏附能力。
　　 (4)AS損傷后integrinβ的表達(dá)量未發(fā)生明顯變化，而MMP-2和MT1-MMP都有明顯的上調(diào)；RNA干擾后AS的integrin