血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶1在早期自然流產(chǎn)中的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 SGK1在早期流產(chǎn)子宮蛻膜組織中的表達(dá)改變
　　目的:
　　通過(guò)測(cè)定妊娠早期蛻膜組織中血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶1(SGK1)的表達(dá)，比較早期自然流產(chǎn)和正常妊娠蛻膜組織中SGK1表達(dá)的差異，探討SGK1在妊娠早期母胎界面微環(huán)境中的生物學(xué)意義。
　　材料及方法:
　　1.選擇妊娠早期不明原因自然流產(chǎn)者88例作為實(shí)驗(yàn)研究組，同期71例的正常早期妊娠者作為對(duì)照組。
　　2.免疫組織化學(xué)法及免疫熒光技術(shù)

2、檢測(cè)子宮蛻膜組織中SGK1的表達(dá)。
　　3.TRIZOL法抽提子宮蛻膜組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后Real time PCR測(cè)定兩組子宮蛻膜組織中SGK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。
　　4.用含蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白質(zhì)裂解液提取人子宮蛻膜組織蛋白質(zhì)，采用BCA法進(jìn)行組織蛋白定量，Western blot技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)人子宮蛻膜組織中SGK1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1.早期自然流產(chǎn)組和正常妊娠組在年齡、妊娠周

3、數(shù)、初潮年齡、月經(jīng)周期、行經(jīng)天數(shù)等方面無(wú)顯著差異。早期自然流產(chǎn)患者血清雌二醇(E2)的水平低于正常妊娠者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。
　　2.免疫組織化學(xué)法及免疫熒光發(fā)現(xiàn)SGK1在早期自然流產(chǎn)患者和正常妊娠者的子宮蛻膜組織中均有表達(dá)。
　　3.早期自然流產(chǎn)患者蛻膜組織中的SGK1的mRNA水平較早期正常妊娠者蛻膜組織中的表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。
　　4.早期自然流產(chǎn)患者子宮蛻膜組織中SG

4、K1總的蛋白質(zhì)表達(dá)低于正常妊娠者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。并且，早期自然流產(chǎn)患者子宮蛻膜組織中SGK1磷酸化的蛋白表達(dá)低于正常妊娠者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），這與SGK1總蛋白在兩組之間的表達(dá)趨勢(shì)相一致。
　　5.早期自然流產(chǎn)患者子宮蛻膜組織中SGK1的磷酸化蛋白與總蛋白的比值低于正常妊娠組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　結(jié)論:
　　1.SGK1在早期妊娠子宮蛻膜組織中表達(dá)。<

5、br>　　2.早期自然流產(chǎn)患者蛻膜組織中的SGK1的mRNA水平、總蛋白以及活化的蛋白表達(dá)均下降。
　　第二部分 SGK1的下調(diào)與早期自然流產(chǎn)發(fā)生相關(guān)機(jī)理研究
　　目的:
　　通過(guò)建立體外子宮蛻膜細(xì)胞，以蛻膜細(xì)胞中SGK1蛋白活性的變化為著眼點(diǎn)，進(jìn)一步探究早期自然流產(chǎn)的發(fā)生機(jī)理，為病理妊娠發(fā)病機(jī)制及防治的研究提供新的思路和途徑。
　　材料及方法:
　　1.培養(yǎng)體外子宮蛻膜細(xì)胞，用免疫熒光法鑒定其純度。

6、>　　2.MTT比色試驗(yàn)檢測(cè)蛻膜細(xì)胞增殖活性，AnnexinⅤ-FITC/PI檢測(cè)蛻膜細(xì)胞凋亡。
　　3.靶向性SGK1 siRNA干擾研究SGK1對(duì)蛻膜細(xì)胞凋亡的影響。
　　4.脂多糖處理蛻膜細(xì)胞建立自然流產(chǎn)的體外細(xì)胞模型。
　　5.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定蛻膜細(xì)胞上清中的細(xì)胞因子的含量。
　　結(jié)果:
　　1.靶向性SGK1 siRNA轉(zhuǎn)染24小時(shí)后的子宮蛻膜細(xì)胞的凋亡高于對(duì)照組蛻膜細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0

7、.01)。
　　2.經(jīng)雌二醇刺激蛻膜細(xì)胞中SGK1的表達(dá)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3.SGK1經(jīng)雌二醇活化后使脂多糖所引起的蛻膜細(xì)胞下降的增殖活性有一定程度的恢復(fù)。SGK1的活化使脂多糖所引起的蛻膜細(xì)胞凋亡的升高有一定程度的恢復(fù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);并且使脂多糖所引起的蛻膜細(xì)胞抗凋亡基因BCL-2和XIAP的降低有一定程度的恢復(fù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）
　　4.SGK1

8、經(jīng)雌二醇的刺激后活化增加IL-4和IL-5細(xì)胞因子的分泌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001和P＜0.01）;SGK1活化后下調(diào)IFN-γ細(xì)胞因子的分泌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）;SGK1的活化上調(diào)細(xì)胞因子IL-4/IFN-γ的比值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　5.SGK1經(jīng)雌二醇活化后可以使脂多糖處理所導(dǎo)致的增加的磷酸化的NF-κ B蛋白下降以及活化的NF-κB蛋白下調(diào)(P＜0.01)。
　　結(jié)論: