糖皮質激素抵抗的分子機制研究——糖皮質激素受體啟動子在激素反應性中的作用.pdf

1、研究背景：神經內分泌免疫學是指人體神經系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)存在動態(tài)的相互聯(lián)系，從整體水平上對機體做出調節(jié)，使機體對內在或者外來的應激因素做出反應，在維持機體內環(huán)境的穩(wěn)定中起到重要作用。其中下丘腦-垂體-腎上腺軸(Hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)是神經內分泌免疫網絡最重要的一個調節(jié)通路。糖皮質激素(Glucocorticoids，GC)是HPA軸的關鍵性分子，在神經內分泌免疫網絡的對話中起著很重

2、要的溝通作用。在人體內，GC對免疫系統(tǒng)有著全面的調節(jié)性作用。這是使用外源性GC治療很多免疫相關性疾病的一個重要理論基礎。而越來越多的證據(jù)表明，臨床上免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展是免疫調節(jié)不平衡的結果，過去所有的治療都集中在如何單方面抑制免疫系統(tǒng)的活動，而不去注意機體內在免疫調節(jié)的機制——神經內分泌免疫調節(jié)網絡，所以到目前為止，免疫性疾病的治療仍然沒有突破性進展。神經內分泌免疫調節(jié)作用的重要靶細胞是人體免疫功能主要的執(zhí)行者——外周血單個核細胞(P

3、eripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)。PBMCs對GC的反應性，存在很大的個體差異。對GC的反應性低下不單使外源性GC的治療不能達到預期的效果，也使機體內源性的GC不能完全發(fā)揮其免疫調節(jié)作用，成為免疫相關性疾病的發(fā)生發(fā)展的一個重要誘因。GC效應的發(fā)揮主要通過其受體——糖皮質激素受體(Glucocorticoid receptor，GR)實現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，GR基因的啟動子區(qū)存在多個啟動子，均能獨立啟

4、動GR的轉錄和翻譯。不同啟動子的使用會影響GR轉錄和翻譯的結果，形成多種mRNA和蛋白質亞型。而多種GR亞型的存在，可能是GC反應多樣化的一個重要分子基礎。GR的啟動子上還存在多個順式作用元件，反式作用因子如轉錄因子可以與其結合調節(jié)GR的表達?；罨腉R本身就可以和GR的啟動子區(qū)結合，實現(xiàn)對自身表達的調控。因此GR啟動子區(qū)對GC的反應性可能起著重要的調節(jié)作用。然而，目前對GR啟動子在GC抵抗中的作用尚有爭議，大部分的報道是來自于血液系統(tǒng)

5、的惡性腫瘤。
　　 目的：以PBMCs和原發(fā)性腎病綜合征為研究目標，探討GR啟動子的使用對GC反應性的影響。在PBMCs中，GR啟動子的使用和亞型的表達情況以及兩者的關系；PBMCs中是否存在和啟動子使用相關的GR自我調節(jié)機制。；原發(fā)性腎病綜合征患者激素抵抗的現(xiàn)象是否和上述機制存在聯(lián)系。
　　 方法：⑴采用半定量RT-PCR方法檢測PBMCs中GR啟動子的使用和亞型的表達情況，并與人體其他細胞(HepG2，HK-2)進行

6、對比。對PBMCs中GR各個第一外顯子(exon1s)和亞型的相對表達量進行相關性分析。⑵使用RT-PCR及western-blot檢測在GC刺激下，PBMCs中exon1A和GR表達的變化，再進一步使用Real-time PCR對GC刺激下PBMCs中GR exon1s和亞型的表達情況進行精確的測定。⑶使用Real-timePCR測定對激素反應性不同的INS患者GRexon1s和亞型的表達情況，并進行對比。western-blot檢測

7、兩者病人GR蛋白表達上的差異。
　　 結果：①在PBMCs、HepG2、HK-2三種細胞中，均表達GR exon1C，exon1B，GR-α，GR-P。而exon1A特異性表達于PBMCs中。PBMCs中GR功能性亞型GR-α的表達量和exon1C以及exon1A都有密切的相關，而另一亞型GR-P的表達和exon1B相關。②GC的刺激可以誘導PBMCs中GR及GR exon1A表達的上調，上調的GR亞型主要是由exon1A啟動轉

8、錄的GR-α。在不表達exon1A的HepG2細胞中，GC的刺激會誘導GR表達的下降。③在對激素反應性不同的INS患者中，存在不同的啟動子使用方式，激素敏感的病人以GR exon1A為主，而激素抵抗的病人以exon1C為主，但兩者在總的GR表達量上以及各個亞型的表達量上無明顯差異。
　　 結論：⑴GR的啟動子使用方式有著組織的特異性。其中啟動子1A只特異性的表達于PBMCs中。啟動子1C是啟動GR基礎表達主要的啟動子。不同啟動子

9、的使用和不同GR mRNA亞型的表達密切相關。在PBMCs中，GR-α的表達來源于啟動子1A和1C啟動的轉錄，而GR-P的表達來源于啟動子1B的轉錄。⑵不同細胞對GC的刺激表現(xiàn)出不同的反應。在HepG2細胞中，GC的刺激會引起GR生理反饋性的下降。而在PBMCs中，GC的刺激會引起GR表達的增多，上調的GR主要為功能性亞型GR-α。這種效應有助于進一步擴大GC在PBMCs中的作用。啟動子1A在GR的上調機制中起到重要的作用，因為上調的G