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文檔簡介
1、研究背景:
肝郁脾虛證指由于肝氣郁結(jié),疏泄失司,導(dǎo)致脾胃功能紊亂,出現(xiàn)肝木克脾土的情況,表現(xiàn)為消極、適應(yīng)能力低下、泄瀉、體重降低、飲食減少等?,F(xiàn)代生活節(jié)奏的加快,工作壓力、社會競爭、起居調(diào)攝失宜等原因,造成人們心里負荷加重,情志抑郁,氣機失于調(diào)達,而致肝郁脾虛證成為臨床的常見證候。隨著生物—心理—社會醫(yī)學(xué)模式的建立,肝郁脾虛證在各種疾病的發(fā)生發(fā)展中的重要作用也逐漸被認識到,因此對于肝郁脾虛證的研究也得到了進一步的關(guān)注。
2、 長期以來,中醫(yī)研究者們一直試圖從多系統(tǒng)、多層次、多角度來詮釋肝郁脾虛證的實質(zhì),挖掘其臨床變化的物質(zhì)基礎(chǔ)。通過多年的研究和探索發(fā)現(xiàn)肝郁脾虛證的發(fā)生和應(yīng)激密切相關(guān)[1],且海馬和前額皮質(zhì)是應(yīng)激過程中的易感腦區(qū)[2]。長期暴露于應(yīng)激狀態(tài)下,使HPA軸脫抑制,糖皮質(zhì)激素維持在較高水平,使海馬和前額皮質(zhì)(Prefrontal cortex,PFC)腦區(qū)受損,膠質(zhì)細胞變性、錐體細胞萎縮、突觸蛋白PSD95和突觸蛋白Ⅰ表達下調(diào),而這些改變均與PF
3、C的認知功能損害相關(guān)[3]。
機體應(yīng)激可以使糖皮質(zhì)激素水平升高,同時腦中谷氨酸水平也隨之大幅升高。谷氨酸濃度和作用時限超出生理范圍,則會導(dǎo)致興奮性神經(jīng)毒性的產(chǎn)生,損傷神經(jīng)元。這就是社會應(yīng)激如致情感障礙的病理機制之一。這一機制與長期應(yīng)激導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細胞( Astrocyte, As)損傷及興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體(Excitatory Amino Acid Transporters,EAATs)功能障礙相關(guān)。研究證實[4],突觸間隙
4、約80%~90%的興奮性氨基酸的轉(zhuǎn)運全部依賴 As、EAAT1和 EAAT2來完成,因此 As在維持突觸間隙谷氨酸濃度和抑制興奮性氨基酸毒性中發(fā)揮了重要作用。另外有研究表明,獲得性無助應(yīng)激可以使大鼠海馬和皮層的EAAT1和EAAT2表達顯著減少[5]。綜上所述,長期應(yīng)激可致As損傷及EAATs功能障礙,不能對應(yīng)激誘導(dǎo)的突觸間隙中谷氨酸進行抑制,誘發(fā)興奮性氨基酸毒性,破壞神經(jīng)元可塑性。研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激可導(dǎo)致動物前額皮質(zhì)區(qū)星形膠質(zhì)細胞密度降
5、低[6],另外有研究表明慢性不可預(yù)見性應(yīng)激可使小鼠前額皮質(zhì)膠質(zhì)纖維酸性蛋白( glial fibrillary protein,GFAP)蛋白表達減少[7-9]。膠質(zhì)細胞數(shù)目和形態(tài)的改變與膠質(zhì)細胞功能損傷可能互為因果,且應(yīng)激又可導(dǎo)致 GFAP表達減少。從而提示前額皮質(zhì)區(qū)星形膠質(zhì)功能受損可能參與長期慢性應(yīng)激導(dǎo)致的肝郁脾虛證的發(fā)生,但是關(guān)于肝郁脾虛證的這一機制研究目前尚無相關(guān)報道。
研究目的:
本研究對長期慢性復(fù)合應(yīng)激誘
6、導(dǎo)的肝郁脾虛證小鼠前額皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞谷氨酸調(diào)節(jié)功能變化及逍遙散的治療機制進行了研究,以期為肝郁脾虛證的實質(zhì)和其生物學(xué)內(nèi)涵的詮釋奠定基礎(chǔ),為肝郁脾虛證的治療尋找新的藥物作用靶點。
研究方法:
1.實驗選用成年C57BL/6J雄性小鼠80只,10周齡,隨機分為正常組,模型組,逍遙散組和氟西汀組,每組20只。正常組5只1籠,其余3組單籠孤養(yǎng)。
2.適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后,除正常組外,其余各組小鼠均以復(fù)合應(yīng)激方法制作2
7、1天肝郁脾虛證小鼠模型,同時模型組、逍遙散組和氟西汀組小鼠分別進行生理鹽水、逍遙散和氟西汀灌胃干預(yù)。
3.對小鼠體重、攝食量及宏觀表征進行觀察和記錄。
4.以曠場實驗、高架十字迷宮實驗、新環(huán)境抑制進食實驗、強迫游泳實驗和糖水實驗對小鼠的行為學(xué)進行評價。
5.比色法檢測小鼠血清D-木糖含量的改變。
6.HE染色觀察小鼠前額皮質(zhì)病理改變。
7.ELISA方法檢測小鼠前額皮質(zhì)bFGF、TGF-
8、β1、BDNF和NGF的含量。
8.比色法檢測小鼠前額皮質(zhì)谷氨酸(Glu)濃度。
9.Western Blot和免疫組化方法檢測小鼠前額皮質(zhì)GFAP、NeuN、EAAT1和EAAT2蛋白的表達。
10.Quantitative Real-time PCR(qPCR)方法檢測小鼠前額皮質(zhì)中的GFAP、NeuN、EAAT1和EAAT2基因的表達。
11.尼氏染色觀察小鼠前額皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)目。
9、> 研究結(jié)果:
1.各組小鼠一般情況比較:模型組小鼠表現(xiàn)由易怒轉(zhuǎn)變?yōu)榈吐?,毛發(fā)凌亂無光澤,扎堆少動,灌胃抵抗弱,便溏。氟西汀組和逍遙散組上述反應(yīng)較輕,而正常組未見明顯異常表現(xiàn)。各組小鼠體重增長存在顯著差(P<0.01),模型組和逍遙散組小鼠體重增長緩慢(P<0.01),而氟西汀組小鼠體重增長速度介于正常組和模型組之間。各組小鼠攝食量差異顯著(P<0.01),模型組小鼠攝食量顯著減少(P<0.01),而氟西汀和逍遙散組攝食量較
10、模型組顯著增加(P<0.05)。
2.行為學(xué)檢測結(jié)果比較:強迫游泳實驗發(fā)現(xiàn)模型組5 min內(nèi)不動時間顯著增加,氟西汀和逍遙散組5 min內(nèi)不動時間較模型組顯著減少(P<0.05)。曠場實驗提示模型組中央?yún)^(qū)進入次數(shù)和停留時間較正常組顯著減少(P<0.01),而氟西汀和逍遙散組中央?yún)^(qū)停留時間較模型組顯著減少(P<0.05),且總運動距離較模型組顯著增加(P<0.05)。高架十字迷宮實驗顯示,模型組開放臂停留時間比例較正常組顯著減少
11、(P<0.01),逍遙散組開放臂停留時間比例較模型組顯著增加(P<0.05)。各組小鼠糖水偏好差異顯著(P<0.01),模型組糖水偏好顯著小于其他三組(P<0.05)。
3.血清D-木糖含量比較:模型組血清 D-木糖較正常組和逍遙散組顯著減少(P<0.05),而氟西汀組血清D-木糖較模型組無顯著差異(P>0.05),較逍遙散組顯著減少(P<0.05)。
4.HE染色顯示:模型組小鼠前額皮質(zhì) PrL區(qū)組織細胞出現(xiàn)排列紊
12、亂,胞體縮小,胞漿濃縮紅染,核膜核仁分界不清,異染色質(zhì)較多,核皺縮深染等病理表現(xiàn),而逍遙散組和氟西汀組上述改變明顯減輕。
5.ELISA檢測顯示:模型組BDNF和NGF含量顯著減少(P<0.05),另外模型組和氟西汀組bFGF含量顯著升高(P<0.01),且逍遙散和氟西汀組NGF含量較模型組顯著增加(P<0.05)。
6.比色法檢測顯示:模型組小鼠前額皮質(zhì)谷氨酸濃度顯著增加(P<0.01),逍遙散和氟西汀組谷氨酸濃度
13、較模型組顯著降低(P<0.01)。
7.免疫組化檢測顯示:模型組小鼠前額皮質(zhì)GFAP、EAAT1、EAAT2蛋白陽性細胞數(shù)和OD值均顯著下降(P<0.01),且NeuN蛋白OD值顯著下降(P<0.01);逍遙散組GFAP、EAAT1和EAAT2蛋白陽性細胞數(shù)和OD值,及NeuN蛋白OD值較模型組均顯著上升(P<0.05);氟西汀組EAAT2蛋白陽性細胞數(shù)和OD值、EAAT1、GFAP、NeuN蛋白OD值較模型組均顯著上升(P<
14、0.05)。
8.Western Blot檢測顯示:模型組小鼠前額皮質(zhì)中GFAP、NeuN、EAAT1和 EAAT2蛋白的表達均顯著下降(P<0.01),逍遙散組 GFAP、EAAT1和NeuN蛋白表達較模型組顯著上升(P<0.05),而氟西汀組GFAP、EAAT1、EAAT2和NeuN蛋白表達較模型組均顯著上升(P<0.05)。
9.qPCR檢測顯示:模型組小鼠前額皮質(zhì)中的 EAAT2基因表達顯著下降(P<0.01
15、),GFAP、EAAT1和 NeuN基因表達雖存在下降趨勢,但與正常組比較無顯著差異,逍遙散組GFAP、EAAT1、EAAT2和NeuN基因表達較模型組均顯著增加(P<0.05),氟西汀組NeuN和EAAT2蛋白表達較正常組和模型組顯著增加(P<0.05),另外EAAT1和GFAP基因表達較模型組顯著增加(P<0.05)。
10.尼氏染色顯示:模型組神經(jīng)元數(shù)量顯著減少(P<0.01),逍遙散組和氟西汀組神經(jīng)元數(shù)量較模型組顯著增
16、加(P<0.05);另外,模型組小鼠前額皮質(zhì)神經(jīng)元出現(xiàn)排列紊亂、缺失、損傷明顯、形態(tài)不規(guī)則、核邊界模糊、分布不均勻等病理表現(xiàn),逍遙散組僅有少量神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則,而氟西汀組較正常組未見明顯異常。
研究結(jié)論:
1.根據(jù)各組小鼠宏觀表征、各行為學(xué)表現(xiàn)、血清D木糖含量以及“以方測證”理論綜合判定,本研究采用復(fù)合應(yīng)激方法制作小鼠肝郁脾虛證模型的初步嘗試是成功的。
2.根據(jù)肝郁脾虛證模型小鼠前額皮質(zhì)組織形態(tài)的改變、GF
17、AP蛋白和基因表達減少、以及相關(guān)神經(jīng)生長因子含量如BDNF、NGF、TGF-β1和 bFGF含量改變等研究結(jié)果,可綜合判定肝郁脾虛證模型小鼠前額皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞功能有一定程度的損傷。
3.根據(jù)肝郁脾虛證模型小鼠前額皮質(zhì)EAAT1和和EAAT2蛋白和基因的表達減少,以及前額皮質(zhì)谷氨酸濃度大幅增加的研究結(jié)果,可判斷肝郁脾虛證小鼠前額皮質(zhì)谷氨酸循環(huán)障礙,此病理改變與其前額皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞功能障礙密切相關(guān)。
4.根據(jù)肝郁脾虛
18、證小鼠前額皮質(zhì)NeuN蛋白和基因表達減少,神經(jīng)元數(shù)量減少及形態(tài)紊亂等研究結(jié)果可判斷肝郁脾虛證小鼠前額皮質(zhì)神經(jīng)元功能和形態(tài)均受到一定程度的損傷,此病理改變與星形膠質(zhì)細胞功能減弱導(dǎo)致前額皮質(zhì)谷氨酸濃度大幅度增加有著密切的聯(lián)系。
5.逍遙散可通過改善肝郁脾虛證小鼠前額皮質(zhì)組織病理改變、上調(diào)GFAP蛋白和基因的表達、調(diào)節(jié)相關(guān)神經(jīng)生長因子的含量、增加EAAT1和 EAAT2蛋白和基因的表達、降低前額皮質(zhì)谷氨酸含量、增加 NeuN蛋白和基
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