慢性應(yīng)激肝郁脾虛模型大鼠下丘腦外側(cè)區(qū)Orexin A與Orexin receptor1變化及逍遙散調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：觀察慢性應(yīng)激肝郁脾虛模型大鼠下丘腦外側(cè)區(qū)（LHA）食欲素 A（OXA）和食欲素受體1（OX1R）變化及逍遙散的干預(yù)效應(yīng)，探討慢性應(yīng)激致機(jī)體出現(xiàn)食欲下降的中樞神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制及逍遙散的作用機(jī)理。
　　方法：72只健康雄性SD大鼠（體重180±20 g）隨機(jī)分為3組，即空白對(duì)照組（the control group）、模型組（the model group）和逍遙散組（the Xiaoyaosan group），每組24只。標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)

2、物房飼養(yǎng)，室溫（21±1）℃，相對(duì)濕度40％-60%，光照明暗各12 h（明7：00-19：00，暗19：00-7：00）。各組大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食水。模型組和逍遙散組大鼠以捆綁束縛方式（每天3 h連續(xù)21天）建立慢性應(yīng)激肝郁脾虛動(dòng)物模型。于每天束縛前30 min逍遙散組大鼠灌服逍遙散混懸液（3.85 g-1·kg-1·d-1），模型組大鼠灌服等體積生理鹽水。空白對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)，灌服等體積生理鹽水。根據(jù)大鼠體重調(diào)整用藥量。

3、r>　　各組大鼠均于每日灌胃前稱取體重及攝食、飲水量，同時(shí)觀察大鼠皮毛、糞粒性狀、束縛反應(yīng)等外觀表現(xiàn)；于實(shí)驗(yàn)第0、7、21天進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)（OFT）和高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)（EPM）觀測(cè)各組大鼠行為學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，以2%戊巴比妥鈉（4 mg/100 g體重）腹腔注射麻醉取材：每組隨機(jī)取6只大鼠行左心室升主動(dòng)脈灌注固定，斷頭取腦，以免疫熒光雙染法檢測(cè)LHA中OXA、OX1R與瘦素受體（ob-R）蛋白表達(dá)情況；其余大鼠斷頭取血，并剝離全腦，以間苯

4、三酚法測(cè)定血清 D-木糖含量，以酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測(cè)定血清Leptin含量和腦組織LHA中OXA含量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）方法檢測(cè)LHA中OXA、OX1R、ob-R mRNA表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.各組大鼠一般狀態(tài)情況:實(shí)驗(yàn)期間，大鼠無(wú)死亡。空白對(duì)照組大鼠一般狀態(tài)無(wú)明顯變化，耳廓和鼻頭紅潤(rùn)，眼角清潔，眼球運(yùn)動(dòng)靈活，皮毛色白光澤，大便成顆粒狀且干濕適中。束縛造模后，模型組大鼠在第1周表現(xiàn)出易激

5、惹狀態(tài)，提尾根部易反頸抓咬，在籠內(nèi)表現(xiàn)出弓背、毛發(fā)豎立的攻擊樣姿態(tài)，束縛時(shí)易從束縛架上掙脫，或啃咬束縛帶或束縛架；束縛第2周模型大鼠警惕性強(qiáng)，但束縛時(shí)反抗、撕咬和掙脫等表現(xiàn)稍減；第3周，捕捉時(shí)模型大鼠反抗減弱，蜷臥懶動(dòng)，喜扎堆趴窩，毛發(fā)雜亂枯黃無(wú)光澤，大便時(shí)干時(shí)稀，眼角有分泌物，耳廓和鼻頭顏色變淡，束縛時(shí)幾無(wú)反抗，束縛過(guò)程中多嗜睡，但易驚醒，解除束縛放回籠中后多聚集蜷縮。逍遙散組大鼠在束縛之初與模型組大鼠表現(xiàn)基本無(wú)差異，束縛1周后激惹狀

6、態(tài)較模型組有所緩解；束縛2周后，逍遙散大鼠動(dòng)作較模型大鼠靈活，大便成形且干濕適中，耳廓和鼻頭稍有色淡但亦顯紅潤(rùn)，眼角較為清潔，偶有分泌物，皮毛稍有黯淡，但仍不失光澤整齊清潔。
　　2.各組大鼠體重、攝食量和攝水量變化情況:與空白對(duì)照組大鼠比較，模型組大鼠體重增長(zhǎng)減緩，攝食量和攝水量總體呈減少趨勢(shì)；與模型組比較，逍遙散組大鼠體重、攝食量和攝水量均有所改善。
　　3.各組大鼠行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果:與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)第7天和第21天

7、，模型組大鼠在曠場(chǎng)試驗(yàn)中5 min移動(dòng)總距離，中央?yún)^(qū)移動(dòng)距離、停留時(shí)間及總穿格數(shù)均明顯減少；高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠5 min開(kāi)放臂停留時(shí)間及進(jìn)入次數(shù)，中央平臺(tái)停留時(shí)間及進(jìn)入次數(shù)，以及進(jìn)入封閉臂次數(shù)亦明顯減少，但在封閉臂內(nèi)的停留時(shí)間增加。與模型組比較，逍遙散組上述指標(biāo)總體改善。
　　4.間苯三酚法檢測(cè)血清D-木糖含量結(jié)果:與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清D-木糖含量下降；與模型組比較，逍遙散組大鼠血清D-木糖含量顯著升高。

8、>　　5.ELISA方法檢測(cè)各組大鼠血清Leptin和LHA中OXA含量結(jié)果:與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清Leptin含量顯著升高， LHA中OXA含量減少；與單純應(yīng)激模型大鼠比較，逍遙散組大鼠血清Leptin含量明顯下調(diào)，LHA中OXA含量上調(diào)。
　　6.免疫熒光雙染法檢測(cè)LHA中OXA、OX1R與ob-R蛋白表達(dá)結(jié)果:OXA與OX1R被標(biāo)記為紅色熒光，ob-R標(biāo)記為綠色熒光。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠LHA

9、中OXA與OX1R的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)、陽(yáng)性表達(dá)面積和積分光密度（IOD）均明顯下降，但ob-R表達(dá)增加。與模型組比較，逍遙散組上述指標(biāo)明顯改善。共表達(dá)結(jié)果顯示，模型組 OXA與 ob-R的相關(guān)系數(shù)（Pearson’s correlation）較空白對(duì)照組升高；與模型組比較，逍遙散組OXA與ob-R的相關(guān)系數(shù)升高。與空白對(duì)照組比較，模型組OX1R與ob-R的相關(guān)系數(shù)較空白對(duì)照組下降；模型組和逍遙散組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　7.qR

10、T-PCR方法檢測(cè)LHA中OXA mRNA、OX1R mRNA與ob-R mRNA表達(dá)結(jié)果:與空白對(duì)照組比較，模型組OXA mRNA與OX1R mRNA表達(dá)水平明顯下降，ob-R mRNA表達(dá)水平則明顯上升；與模型組比較，逍遙散組大鼠OXA mRNA與OX1R mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，ob-R mRNA則下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1.慢性應(yīng)激致肝郁脾虛樣模型大鼠出現(xiàn)食少便溏、體重增長(zhǎng)減緩等脾胃失于健運(yùn)的原因與LHA中OXA與