慢性應激肝郁脾虛模型大鼠下丘腦弓狀核ob-R、CART、α-MSH變化及逍遙散調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：觀測慢性應激肝郁致脾虛模型大鼠下丘腦弓狀核（ARC）瘦素受體（ob-R）、可卡因-安非他明調(diào)節(jié)轉錄因子(CART)和α-促黑素細胞激素（α-MSH）基因和蛋白表達變化，揭示肝郁脾虛證可能的生物學基礎；同時以效方逍遙散進行干預，探討其疏肝解郁、健脾以調(diào)節(jié)食欲的作用靶點與機制。
　　方法：構建神經(jīng)肽Y（NPY）RNA干擾質粒腺病毒載體（pAd-NYi），將未轉染質粒的腺病毒作為對照（Ad-NT），并體外驗證pAd-NYi干擾NP

2、Y效應。
　　SD健康雄性大鼠，體重180-200 g。清潔級動物房飼養(yǎng)：室溫（21±1）℃，相對濕度40％～60%，光照明暗各12 h（明7：00～19：00，暗19：00～7：00），自由進食水。適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為7組，正常組、模型組、逍遙散組、pAd-NYi組、pAd-NYi+逍遙散組、Ad-NT組、假手術組各25只。將pAd-NYi組、pAd-NYi+逍遙散組、Ad-NT組大鼠分別于腦立體定位儀下行雙側 ARC注射

3、 pAd-NYi或Ad-NT，假手術組大鼠針尖停留2分鐘，不予注射任何物質。
　　注射完畢，大鼠恢復1周，正常組大鼠不施加應激措施，常規(guī)飼養(yǎng)；用藥組（逍遙散組、pAd-NYi+逍遙散組）每次束縛造模前30min給大鼠灌胃逍遙散（3.85g/kg體重/天）；正常組、模型組、pAd-NYi組、Ad-NT組、假手術組大鼠灌服等體積生理鹽水。
　　注射前觀測正常組、模型組、逍遙散組大鼠體重、攝食量、行為學指標（曠場實驗、高架十字迷宮

4、實驗）作為第0天數(shù)據(jù)。注射完畢束縛應激正式開始后，觀測正常組、模型組、逍遙散組大鼠束縛第7、14、21天體重、攝食量、一般狀態(tài)，和束縛第7、21天各組大鼠行為學變化（曠場實驗、高架十字迷宮實驗）；于束縛應激后第22天取材，間苯三酚法檢測各組大鼠血清 D-木糖變化，對動物模型進行綜合評價。
　　同時，于束縛應激后第22天取材，免疫熒光雙染（IF）、實時熒光定量（qRT-PCR）方法檢測各組大鼠下丘腦ARC中ob-R、CART、α-M

5、SH、NPY基因與蛋白表達水平。
　　結果：
　　1.大鼠一般狀態(tài)、體重、攝食量和行為學變化:束縛前，正常組、模型組、逍遙散組大鼠一般狀態(tài)良好，體重和攝食量、行為學指標均無統(tǒng)計學差異。束縛應激21天后，模型組大鼠神態(tài)倦怠、蜷縮角落、弓背少動、反應遲鈍、皮毛暗淡無光澤，眼角、耳廓色淡，糞便溏稀不調(diào)；5min大鼠曠場實驗活動總路程較正常組呈現(xiàn)減少的趨勢；高架十字實驗模型大鼠進入開放臂次數(shù)和在開放臂停留時間呈下降趨勢，進入封閉臂次

6、數(shù)及在封閉臂停留時間呈現(xiàn)增加的趨勢；并且21天模型大鼠血清D-木糖含量較正常大鼠明顯下降。逍遙散組大鼠體重、攝食量和一般外觀表現(xiàn)均較模型組有所改善；曠場實驗和高架十字實驗逍遙散組大鼠自主活動能力增強，對新異環(huán)境探究行為增加；并且血清 D-木糖含量明顯高于模型大鼠。表明21天持續(xù)束縛應激引發(fā)大鼠出現(xiàn)了挫折、憂郁、恐懼心理，并伴隨胃腸功能下降，出現(xiàn)了中醫(yī)肝郁脾虛證候的表現(xiàn)。
　　2.pAd-NYi對慢性應激肝郁脾虛模型大鼠下丘腦ARC

7、中NPY表達的干擾:免疫熒光雙染和 qRT-PCR結果表明：隨著束縛應激因素的持續(xù)施加，模型組、pAd-NYi組大鼠下丘腦ARC中NPY陽性表達神經(jīng)元的陽性表達面積（Area，μm2）、積分光密度（IOD）、平均光密度（MOD）、陽性細胞表達數(shù)（SUM）及NPY mRNA基因表達與正常組比較均有所下降；與模型組比較，pAd-NYi組NPY蛋白和基因表達亦明顯下降;與pAd-NYi組比較，Ad-NT組、假手術組、pAd-NYi+逍遙散組大

8、鼠NPY蛋白和基因表達均有所增加。說明應激因素可導致下丘腦 ARC中NPY的陽性表達有所減少，并且所構建的腺病毒pAd-NYi質粒能明確干擾NPY的表達。
　　3.慢性應激肝郁脾虛模型大鼠下丘腦 ARC中 ob-R、CART、α-MSH蛋白和基因表達情況:與正常組比較，模型組、pAd-NYi組大鼠下丘腦ARC中ob-R、CART、α-MSH蛋白和基因表達明顯升高。與模型組比較，Ad-NT組、假手術組 ob-R、CART、α-MSH

9、蛋白和基因表達無明顯差異，pAd-NYi組 ob-R、CART、α-MSH表達有所升高，而逍遙散組則表達明顯減少。與pAd-NYi組比較，模型組、Ad-NT組、假手術組大鼠下丘腦ARC ob-R、CART、α-MSH表達均有所下降， pAd-NYi+逍遙散組大鼠亦有所減少，其中 CART積分光密度下降最為明顯。
　　結論：
　　1.所采用的腺病毒 NPY干擾質粒能明確干擾模型大鼠下丘腦ARC中NPY的表達。
　　2.下