miRNA-451對(duì)RF-6A視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)影響.pdf

1、研究目的：
　　探究miRNA-451對(duì)RF/6A視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及管腔形成能力等生物學(xué)特征的影響及其可能的機(jī)制，為增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將 miRNA-451的類似物（mimic）和抑制劑（inhibitor）轉(zhuǎn)染進(jìn)RF/6A細(xì)胞中，測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。
　　2.將RF/6A細(xì)胞分為四個(gè)組：miRNA-451 mimic組、miRNA-451 m

2、imic control（類似物對(duì)照）組、miRNA-451 inhibitor組、miRNA-451 inhibitor control（抑制劑對(duì)照）組，利用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，Matrigel管腔形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞形成管腔的能力。RT-PCR檢測(cè)與生物學(xué)行為相關(guān)基因的表達(dá)情況。
　　3.以miRNA-451為研究對(duì)象，利用miRBase、miRanda、Targe

3、tScan、PicTar等數(shù)據(jù)庫對(duì)miRNA-451的作用靶點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為實(shí)驗(yàn)提供理論指導(dǎo)和依據(jù)。
　　4.利用SPSS19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間的兩兩比較需要采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P<0.05則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)的結(jié)果顯示，6h后miRNA-451 mimic組在20uM時(shí)即有較高的轉(zhuǎn)染效率，miRNA-451 inhibi

4、tor組在80uM的轉(zhuǎn)染效率較高。
　　2.CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：24h時(shí)，mimic組（1.049±0.020）較mimic control組（1.258±0.034）低，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.413，P=0.000）。48h時(shí)mimic組（1.223±0.077）較mimic control組（1.400±0.037）低，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=2.401，P=0.002）。inhibitor組與inhibito

5、r control組相比較，24h時(shí)，兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），48h時(shí)，inhibitor組（1.748±0.023）較inhibitor control組（1.689±0.421）高，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=1.407，P=0.000）。
　　3.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miRNA-451 mimic組與mimic control組在觀察的時(shí)間段內(nèi)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。6h時(shí)miRNA-451 inhibitor組（0.106±0.

6、036）較inhibitor control組（0.239±0.030）低，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.039，P=0.008），12h時(shí)miRNA-451 inhibitor組（0.248±0.045）較inhibitor control組（0.445±0.053）低，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.227，P=0.008）。24h時(shí)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　4. Transwell結(jié)果顯示：miRNA-451 mimic組與

7、mimic control組在觀察的時(shí)間段內(nèi)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。miRNA-451 inhibitor組（57.750±8.655）較inhibitor control組（103.000±9.618）低，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.011，P=0.000）。
　　5. Matrigel管腔形成結(jié)果顯示：miRNA-451 mimic（60.667±8.7369）組較mimic control（16.000±6.000）組高

8、，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.688，P=0.002）。miRNA-451 inhibitor組（24.667±3.786）較inhibitor control組（65.333±5.033）低，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.163，P=0.000）。
　　6. RT-PCR結(jié)果顯示：（1）CyclinA1的表達(dá)，24h時(shí)mimic組（0.424±0.033）低于mimic control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=15.923，P=0.

9、000），inhibitor組（0.042±0.042）低于inhibitor-control組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=14.899，P=0.000）；（2）CyclinD1的表達(dá)，24h時(shí)mimic組（0.744±0.105）低于mimic control組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=5.088，P=0.014），inhibitor組同 inhibitor-control組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；（3）PDGFRα的表達(dá)，24h時(shí)

10、mimic組同mimic control組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），inhibitor組（1.762±0.285）高于inhibitor-control組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=5.549，P=0.01）；（4）MMP2的表達(dá)在24h時(shí)， mimic組（0.535±0.084）低于mimic control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.495， P=0.001），inhibitor組（0.042±0.016）低于inhibi

11、tor-control組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=8.910，P=0.000）。
　　7.生物信息學(xué)結(jié)果表明，miRNA-451主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育、負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞增生及多種酶活性等生物學(xué)過程（P<0.05），可能與轉(zhuǎn)化生長因子-β信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路、表皮生長因子信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、脂肪酸代謝通路（P<0.05）等通路相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.通過脂

12、質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，miRNA-451 mimic和miRNA-451 inhibitor可以有效的上調(diào)或下調(diào) RF/6A血管內(nèi)皮細(xì)胞中 miRNA-451的表達(dá)。結(jié)果顯示抑制細(xì)胞中miRNA-451表達(dá)的結(jié)果更有意義。當(dāng)細(xì)胞中miRNA-451的表達(dá)降低時(shí)，增殖行為所受影響不大，細(xì)胞遷移受到抑制，形成管腔的能力下降，提示利用miRNA-451治療PDR具有潛在的可能性。
　　2.在下調(diào)miRNA-451表達(dá)水平后，Cyclins、PDG