人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中slit2基因?qū)F-6A細(xì)胞遷移及管腔形成的影響.pdf

1、目的：
　　在共培養(yǎng)模型下，觀察人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（retinal pigment epithelial cells,RPE）中slit2基因?qū)γ}絡(luò)膜視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（RF/6A）遷移及管腔形成的影響。
　　方法：
　　1.將腺病毒介導(dǎo)的slit2（Ad-slit2）及空腺病毒載體（Ad-null）轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞24h、48h。通過逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcription Polymerase Ch

2、ain Reaction，RT-PCR）及 Western-blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的RPE細(xì)胞中slit2的表達(dá)水平。
　　2.建立RPE&RF/6A共培養(yǎng)模型，采用Transwell小室法及Matrigel膠體外三維成型法分別檢測(cè)過表達(dá)slit2基因的RPE細(xì)胞對(duì)RF/6A細(xì)胞遷移能力及管腔形成能力的影響，并計(jì)算遷移數(shù)目及形成完整管腔個(gè)數(shù)。
　　3.在缺氧條件下，shRNA-slit2轉(zhuǎn)染RPE細(xì)胞后，利用RT-PCR及Wes

3、tern-blot檢測(cè)slit2的表達(dá)變化。
　　4.建立共培養(yǎng)體系，通過Transwell小室法檢測(cè)缺氧條件下，抑制RPE細(xì)胞中的slit2基因?qū)F/6A細(xì)胞遷移能力的影響并計(jì)算遷移數(shù)目；采用Matrigel膠體外三維成型法檢測(cè)缺氧條件下，抑制RPE細(xì)胞中的slit2基因?qū)F/6A細(xì)胞管腔形成能力的影響及測(cè)量形成完整管腔的個(gè)數(shù)。
　　5.RT-PCR、Western-blot及ELISA檢測(cè)缺氧條件下抑制RPE細(xì)胞中的

4、slit2后VEGF的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.Ad-slit2轉(zhuǎn)染24h、48h后，RPE細(xì)胞中slit2mRNA和蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組均明顯增高。
　　2.在RPE&RF/6A共培養(yǎng)下，空白對(duì)照組、Ad-null轉(zhuǎn)染24h組、Ad-slit2轉(zhuǎn)染24h組、Ad-null轉(zhuǎn)染48h組、Ad-slit2轉(zhuǎn)染48h組中， RF/6A細(xì)胞遷移數(shù)目分別是（40.6±4.5）、（36.7±3.5）、（67.7±4.2

5、）、（36.0±3.6）、（79.7±3.5）；形成完整管腔個(gè)數(shù)分別是（8.7±3.2）、（8.9±3.6）、（15.9±4.2）、（8.3±2.4）、（23.3±4.5）。Ad-slit2轉(zhuǎn)染24h及48h組與空白對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3.在缺氧條件下，經(jīng)shRNA-slit2轉(zhuǎn)染后，RPE細(xì)胞中的slit2mRNA和蛋白表達(dá)降低。
　　4.共培養(yǎng)體系中，空白對(duì)照組、缺氧組、缺氧下空腺病毒組

6、、缺氧下shRNA-slit2組中，RF/6A細(xì)胞遷移數(shù)目分別是（36.7±5.5）、（110.0±8.0）、（104.6±14.6）、（61.0±5.3）；形成完整管腔個(gè)數(shù)分別是（6.7±1.5）、（19.7±3.5）、（21.3±3.8）、（10.3±1.6）。缺氧下shRNA-slit2組與缺氧組比較，缺氧組與空白對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　5.RT-PCR、Western-blot及 ELISA