糖皮質(zhì)激素對大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞緊密連接的影響.pdf

1、目的 研究糖皮質(zhì)激素對大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞間緊密連接蛋白表達、分布及其功能的影響，從新的角度對糖皮質(zhì)激素治療黃斑水腫的藥物作用機制進行探討。 方法 一、大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞分離與培養(yǎng) (一)大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的分離純化與原代培養(yǎng) 使用兩種方法對大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞進行分離純化： 1.通過細胞貼壁時間不同對大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞進行分離純化。 自大鼠眼球中分離獲得視網(wǎng)膜后，

2、使用由含有10％胎牛血清的低糖型DMEM配制成的0.1％Ⅰ型膠原酶對視網(wǎng)膜進行消化60分鐘，將消化產(chǎn)物通過75μm和50μm不銹鋼細胞篩網(wǎng)過濾，收集濾液離心1000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘，去上清，加入培養(yǎng)基(含有20％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，100μg/ml血管內(nèi)皮生長添加劑，10U/ml肝素的低糖型DMEM)吹打成細胞懸液，直接接種于培養(yǎng)板上，置37℃，5％CO2孵箱內(nèi)孵育3小時后吸出培養(yǎng)液及未貼壁細胞，加

3、入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。 2.使用CD31抗體包被的免疫磁珠對大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞進行分離純化 (1)制備磁珠 取包被有抗小鼠IgG1抗體的免疫磁珠50μl與20μl小鼠抗大鼠CD31抗體混合，置4℃過夜。使用前，用含有10％胎牛血清的低糖型DMEM洗滌3次，每次置磁珠分離器上15分鐘，備用。 (2)分離細胞 將視網(wǎng)膜按前述方法進行處理，形成單細胞懸液，加入含有10％胎牛血清的低糖型DMEM漂洗一

4、次，再次離心1000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘，去除上清，再加入含有10％胎牛血清的低糖型DMEM約2ml吹打成細胞懸液加入制備好的磁珠，室溫，不斷攪動下孵育一小時。將細胞懸液放置于磁珠分離器上8分鐘，將試管內(nèi)的液體吸出，洗滌6次。將得到的細胞加入培養(yǎng)基(含有20％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，100μg/ml血管內(nèi)皮生長添加劑，10U/ml肝素的低糖型DMEM)吹打成細胞懸液，直接接種于使用纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板上，

5、置37℃，5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。 (二)細胞傳代： 使用0.25％胰蛋白酶對細胞單層進行消化，按1∶3進行傳代。 (三)細胞鑒定： 觀察細胞形態(tài)，并通過免疫熒光方法對細胞內(nèi)vW因子表達進行檢測。二、糖皮質(zhì)激素對細胞間緊密連接的影響 取傳至第四代到第六代視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞，分為低糖組、低糖+地塞米松組、高糖組和高糖+地塞米松組，共四組，并接種于Millicell插入式細胞培養(yǎng)皿、預(yù)置蓋玻片的24孔板

6、和普通24孔板中，分別進行跨細胞電阻測定，緊密連接蛋白occludin、claudin-1和ZO-1的免疫熒光染色以及通過RT-PCR對claudin-1蛋白mRNA表達水平進行檢測。通過預(yù)實驗確定觀察時間為6天。 (一)跨細胞電阻測量 將視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞接種于Millicell插入式細胞培養(yǎng)皿，每日進行跨細胞電阻測量，評估緊密連接功能。設(shè)置1組未接種細胞的空白對照組，每孔每次測定3處電阻值，取其平均電阻值。每孔電阻值

7、=每孔測定平均電阻值-空白對照孔測定平均電阻值。得到的各組數(shù)據(jù)使用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析，規(guī)定P＜0.05時差別有顯著性。 (二)緊密連接蛋白免疫熒光染色 將視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞接種于預(yù)先放置蓋玻片的24孔板中，加入不同成分的培養(yǎng)基后，取處理2、4及6天的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞進行緊密連接蛋白ZO-1、occludin和claudin-1的免疫熒光檢測，觀察緊密連接蛋白在細胞內(nèi)的分布情況。 (三)RT-PCR

8、檢測claudin-1蛋白mRNA表達水平 將視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞接種于普通24孔培養(yǎng)板中，加入四組不同的細胞培養(yǎng)基分別對細胞進行處理，取處理第2、4和6天細胞通過RT-PCR對緊密連接蛋白claudin-1的mRNA表達水平進行檢測。PCR所用引物根據(jù)大鼠claudin-1mRNA序列，使用primer3軟件進行設(shè)計，序列如下： claudin-1上游：5’aggtctggcgacattagtgg3’claudin-1下

9、游：5’gaaggtgttggcttgggata3’PCR產(chǎn)物片段大小為228bp。 結(jié)果 一、大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng) 1.兩種培養(yǎng)方法均可獲得純化的大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞，光學(xué)纖維鏡下細胞形態(tài)無明顯差別。但是通過細胞貼壁時間不同對大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞進行分離純化的方法并不可靠，可重復(fù)性差。 2.培養(yǎng)得到的細胞通過形態(tài)學(xué)標準和免疫熒光鑒定，證實為血管內(nèi)皮細胞。 二、糖皮質(zhì)激素對細胞間緊密連接

10、的影響 (一)跨細胞電阻測量 處理一天時各處理組間電阻值無顯著差異。處理兩天以上，加入地塞米松的兩個處理組電阻值與未加入地塞米松的兩個處理組電阻值之間有差異，通過原始數(shù)據(jù)可以看出前者均較后者高。但是加入地塞米松的兩個處理組電阻值之間和未加入地塞米松的兩個處理組電阻值之間未見明顯差異。通過對相同處理組間，不同處理時間各電阻值進行比較，可以發(fā)現(xiàn)使用地塞米松處理細胞2天后電阻值既可升高并趨于穩(wěn)定。 (二)緊密連接蛋白免

11、疫熒光染色 緊密連接蛋白occludin、claudin-1和ZO-1均表達于視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的胞漿中。低糖組與高糖組細胞緊密連接蛋白的分布未見明顯差異，使用含有地塞米松培養(yǎng)液處理的兩組細胞間緊密連接蛋白分布可見向細胞漿的外周聚集。 (三)RT-PCR檢測claudin-1蛋白mRNA表達水平 使用含有地塞米松培養(yǎng)液培養(yǎng)的兩組細胞間緊密連接蛋白claudin-1mRNA表達水平，均較使用不含地塞米松培養(yǎng)液培養(yǎng)的

12、兩組細胞升高，培養(yǎng)6天時尤其明顯。 結(jié)論 1.使用CD31抗體包被的免疫磁珠對大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞進行分離純化較根據(jù)細胞貼壁速度不同對其進行純化的方法可靠，可重復(fù)性較好。 2.糖皮質(zhì)激素可以使體外培養(yǎng)的大鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞跨細胞電阻升高、緊密連接蛋白重分布并使緊密連接蛋白claudin-1的mRNA表達水平升高。 3.在6天的觀察期內(nèi)，較低糖型DMEM而言，高糖型DMEM未引起緊密連接功能、蛋白分布以