氨基酸饑餓誘導(dǎo)的斜紋夜蛾細(xì)胞程序性死亡的研究.pdf

1、在微生物與宿主細(xì)胞的相互作用過程中，細(xì)胞程序性死亡(Programmed CellDeath，PCD)是宿主一種重要的防御手段，了解宿主細(xì)胞的程序性死亡類型及其分子機制在應(yīng)用微生物防治害蟲等研究中具有重要的意義。程序性細(xì)胞死亡的類型除了經(jīng)典的細(xì)胞凋亡(Apoptosis)外，近年細(xì)胞自噬程序性死亡(Autophagic cell death)的研究也頗受關(guān)注。此外，還有人提出了類凋亡(Paraptosis)、有絲分裂災(zāi)變(Mitotic

2、catastrophe)等新的細(xì)胞程序性死亡類型。
　　 在先前的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)采用放線菌來源的雷帕霉素模擬氨基酸饑餓處理兩種鱗翅目昆蟲細(xì)胞，細(xì)胞死亡的實驗結(jié)果差別很大。處理的家蠶離體細(xì)胞(Bmn-e細(xì)胞)在12h后就能觀察到明顯的細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；而饑餓處理斜紋夜蛾離體細(xì)胞SL則需要48h以上才能觀察到明顯的變化，而這種變化也與Bmn-e細(xì)胞顯著不同。這表明SL細(xì)胞可能對氨基酸饑餓處理有較強的耐受性，細(xì)胞程序性死亡的類

3、型與Bme細(xì)胞的相比，可能存在一些差異。
　　 為了深入探討氨基酸饑餓對SL細(xì)胞的影響，也為了避免雷帕霉素除抑制Tor激酶外對SL細(xì)胞可能的毒性影響，本實驗進一步采用直接剝奪氨基酸法處理SL細(xì)胞，應(yīng)用活體染色、細(xì)胞化學(xué)、酶學(xué)分析、流式細(xì)胞術(shù)和DNA凝膠電泳等多種技術(shù)定性和初步定量研究了處理細(xì)胞的PCD類型，并試圖探尋SL細(xì)胞耐氨基酸饑餓可能的初步機制，為微生物防治害蟲理論的發(fā)展提供參考。實驗結(jié)果表明：饑餓早期，細(xì)胞內(nèi)的溶酶體數(shù)量

4、增多，體積增大，線粒體數(shù)量減少，表明細(xì)胞的自噬水平開始顯著上升。電鏡觀察也表明：饑餓后，部分SL細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了大量的簇狀核糖體顆粒和較多的自噬溶酶體。72-96h，死亡細(xì)胞逐漸增多，96h后細(xì)胞的死亡率才達到45-55％。但是只有少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)碎裂，凋亡小體數(shù)量較少，caspase-3的活性上升，但是遠(yuǎn)低于放線菌素D誘導(dǎo)組，這表明細(xì)胞凋亡只是饑餓細(xì)胞發(fā)生的多種類型的程序性死亡方式之一。但是流式細(xì)胞術(shù)分析表明，在饑餓的后期，細(xì)胞膜上磷脂

5、酰絲氨酸外翻的細(xì)胞可達到38％，而caspase活性遠(yuǎn)低于放線菌素D誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞，表明饑餓后期部分細(xì)胞具有類凋亡的特征。因此，在饑餓條件下，斜紋夜蛾細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡和類凋亡等多種類型的細(xì)胞程序性死亡。
　　 在哺乳動物細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞色素c(cytochrome c，cyto c)具有重要的作用，在昆蟲細(xì)胞凋亡過程中的作用則需要深入研究。本實驗室先前的學(xué)生在早期的研究中發(fā)現(xiàn)，病毒或紫外線誘導(dǎo)SL細(xì)胞凋亡的過程中

6、能夠檢測到cyto c的釋放，應(yīng)用環(huán)孢菌素A阻礙線粒體外膜上通透性轉(zhuǎn)換孔的形成也可以抑制SL細(xì)胞的誘導(dǎo)性凋亡，馬心線粒體細(xì)胞色素c能夠誘導(dǎo)斜紋夜蛾無細(xì)胞體系的凋亡。本文進一步就cyto c對多種無細(xì)胞體系(哺乳動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞)凋亡的誘導(dǎo)進行了初步的比較研究，結(jié)果表明馬心線粒體細(xì)胞色素c誘導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞無細(xì)胞體系中caspase-3的活化的條件不同于昆蟲細(xì)胞無細(xì)胞體系活化所需的條件。
　　 上述這些實驗結(jié)果為昆蟲細(xì)胞程序性死亡