水稻OsVPE3轉(zhuǎn)基因株系表型及其鹽脅迫誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡研究.pdf

1、細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）是一類由基因調(diào)控的、有序的細(xì)胞死亡現(xiàn)象，廣泛存在于動(dòng)植物中，對生物生長發(fā)育、抵抗各類生物及非生物脅迫具有重要作用。在植物中，已鑒定出一系列具有動(dòng)物caspase樣活性和相似結(jié)構(gòu)的PCD調(diào)控蛋白，如液泡加工酶（vacuolar processing enzyme，VPE）等。
　　液泡加工酶是一類具有caspase-1活性的半胱氨酸蛋白酶，為蛋白酶C13家族成員。V

2、PE經(jīng)自我切割產(chǎn)生成熟體后介導(dǎo)植物細(xì)胞程序性死亡，然而其具體的互作蛋白以及調(diào)控途徑仍不清楚。前期研究表明，過表達(dá)抗凋亡基因Bcl-2水稻可抑制脅迫誘導(dǎo)的OsVPE2和OsVPE3轉(zhuǎn)錄并降低PCD發(fā)生，導(dǎo)致抗逆性增強(qiáng)。本研究通過對水稻OsVPE3過表達(dá)和干涉轉(zhuǎn)基因株系的鑒定，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量分析、原生質(zhì)體細(xì)胞膜及液泡染色和免疫共沉淀等技術(shù)，進(jìn)一步探討OsVPE3基因在鹽脅迫誘導(dǎo)PCD通路中的作用機(jī)制。
　　取得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　

3、1.OsVPE3表達(dá)對水稻種子表型的影響
　　通過qRT-PCR鑒定OsVPE3過表達(dá)和RNAi抑制轉(zhuǎn)基因株系，并統(tǒng)計(jì)T3代轉(zhuǎn)基因純系種子長寬和千粒重，結(jié)果表明抑制OsVPE3表達(dá)將引起水稻種子寬度顯著減小，千粒重下降。結(jié)合OsVPE3表達(dá)譜分析，推測OsVPE3可能通過切割貯存蛋白參與種子成熟過程。
　　2.鹽脅迫下OsVPE3干涉株系抗鹽性提高
　　通過3天高鹽處理4周的水稻苗，結(jié)果顯示OsVPE3干涉株系的存活率

4、比野生型顯著提高，且能夠維持更多的葉綠素含量。該結(jié)果表明抑制OsVPE3的表達(dá)可以提高水稻鹽脅迫下的抗逆性。
　　3.抑制OsVPE3表達(dá)可減弱PCD發(fā)生及提高耐鹽性
　　高鹽處理水稻幼苗3天后，通過對主根相對伸長量的測量統(tǒng)計(jì)，以及根尖伊文斯藍(lán)染色發(fā)現(xiàn):與野生型相比，OsVPE3干涉株系根相對伸長量顯著增加，根細(xì)胞活力較強(qiáng)，死亡較少;而OsVPE3過表達(dá)株系與之相反，根相對伸長量減少，細(xì)胞活力較弱，死亡較多。DNA ladd

5、ering檢測顯示，抑制OsVPE3表達(dá)可以明顯減弱基因組DNA片段化，而OsVPE3過表達(dá)會(huì)增強(qiáng)基因組DNA片段化。表明抑制OsVPE3表達(dá)可減弱PCD發(fā)生，從而提高水稻幼苗耐鹽性。
　　4.鹽脅迫下OsVPE3介導(dǎo)水稻液泡破裂引起PCD
　　經(jīng)BCECF-AM和Trypan Blue染色發(fā)現(xiàn)，鹽處理后野生型原生質(zhì)體的液泡膜破裂發(fā)生于細(xì)胞死亡之前，表明液泡的破裂是發(fā)生PCD的前奏。而抑制Os VPE表達(dá)可以顯著增強(qiáng)液泡膜的

6、穩(wěn)定性，抑制液泡破裂，提高原生質(zhì)體存活率。以上結(jié)果說明OsVPE3通過調(diào)控液泡破裂參與鹽脅迫誘導(dǎo)的PCD發(fā)生。
　　5.OsVPE3表達(dá)對水稻葉片和氣孔發(fā)育的影響
　　通過觀察4周水稻的葉片，發(fā)現(xiàn)OsVPE3干涉株系的葉寬明顯小于野生型和過表達(dá)株系，且失水速率最低。同時(shí)，顯微觀察表明，干涉株系的氣孔明顯小于其他株系。通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測氣孔發(fā)育相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)株系中OsTMM、OsSPCH1、OsMUTE和OsFAMA

7、的表達(dá)呈顯著上調(diào)趨勢，而干涉株系中，呈現(xiàn)與之相反的顯著下調(diào)趨勢，表明OsVPE3通過影響氣孔發(fā)育相關(guān)基因，使氣孔變小，影響葉片蒸騰速率。
　　6.OsVPE3蛋白成熟切割及其互作蛋白研究
　　在原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中，利用IP技術(shù)富集OsVPE3-GFP，發(fā)現(xiàn)OsVPE3成熟需進(jìn)行C端切割。通過免疫共沉淀技術(shù)和質(zhì)譜分析，分離純化了OsVPE3-GFP及其可能互作的蛋白，推測參與應(yīng)激反應(yīng)的DnaK family protein